鎘脅迫及MTF1對斑馬魚id1基因的調節(jié)機制.pdf

1、為了研究鎘脅迫及金屬調節(jié)轉錄因子MTF1（metal transcription factor1）對斑馬魚（Danio rerio）id1基因的影響和調節(jié)機制，本碩士學位論文分別利用實時熒光定量 PCR、重組質粒的體外細胞轉染及雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗，探索了可能發(fā)生的部分調節(jié)機制；同時，通過斑馬魚胚胎注射和雙熒光素酶報告系統(tǒng)的方法，對 id1啟動子活性的整體情況及體內外活性的變化進行了研究。具體內容如下：
　　1.鎘脅迫斑馬魚后i

2、d1基因及mtf基因表達量變化分別使用0、1/25和1/5LC50鎘對斑馬魚進行脅迫，4天后對存活斑馬魚對照組及鎘處理組的肝臟、鰓、腸道、脾臟及腎臟分別取材，提取RNA并進行反轉錄，通過實時熒光定量PCR的方法對各組織中 id1、mtf1及 mtf2的表達量變化分別進行了檢測。結果顯示，鎘脅迫斑馬魚96 h后，在肝臟組織中，三個基因表達量均出現了顯著性上調：id1在高濃度組顯著性上調，mtf1和mtf2在低濃度組中分別極顯著和顯著上調；

3、在鰓組織中，id1表達量在高濃度組極顯著升高，在低濃度組有上升趨勢，但沒有顯著性變化。mtf1在低濃度組顯著性下調，高濃度組又呈現上調，與對照組基本持平。mtf2與mtf1變化趨勢相同，但與對照組相比沒有顯著性差異；在腸、脾臟、腎臟組織中，三個基因表達量在鎘脅迫后均呈現出低濃度組逐漸上升，高濃度組先升后降的趨勢，但均沒有顯著性變化。
　　2.雙熒光素酶報告實驗體外研究MTF1對id1基因的調節(jié)機制因MTF1在其他物種中研究較多，且

4、已被廣泛認定為是應答金屬脅迫的主要因子。而 MTF2研究較少且功能不確定。因此，本論文只研究了MTF1對id1的作用。通過生物信息學方法對id1基因啟動子序列進行了分析。發(fā)現，在id1啟動子上5’端翻譯起始位點之前約3kb片段中，存在7個MRE（金屬應答調節(jié)元件）位點，并將其以距離ATG位置最近起始，分別命名為MRE1-7；之后，使用半巢式PCR及引物突變PCR的方法構建了一系列質粒，包括斑馬魚id1啟動子報告質粒（ID1-2.8k-P

5、GL3）以及各MRE位點單點突變質粒（mMRE1-7PGL-3）、MTF1轉錄因子真核表達質粒（MTF1-pcDNA3.1）及其突變體質粒 dnMTF1-pcDNA3.1。通過質粒體外轉染鯉魚上皮瘤（EPC）細胞，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測MTF1轉錄因子（野生型及突變型）對斑馬魚id1啟動子（野生型及突變型）活性變化的影響。結果發(fā)現， MTF1對id1啟動子的活性影響存在濃度依賴性，表現出低促高抑的趨勢，id1啟動子上7個MRE位點對

6、id1啟動子活性的作用存在差異，MRE3、MRE7對id1啟動子活性具有負調節(jié)作用，MRE1、MRE5對id1啟動子活性具有正調節(jié)作用。
　　3.斑馬魚id1啟動子體內外活性分析通過構建斑馬魚id1啟動子不同長度熒光素酶報告質粒，分別以EPC細胞和斑馬魚胚胎為材料進行了體外轉染和體內注射，并采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對不同長度斑馬魚id1啟動子在體內、外的活性情況進行了分析。結果顯示，不同長度id1啟動子活性，在體內、體外實驗中均表現

7、出隨著啟動子長度變化而變化的情況。同時，啟動子活性變化趨勢在體內和體外并不一致，呈現較大差異性。
　　從研究結果得出如下結論：
　　1.鎘對斑馬魚的脅迫可以促進肝臟和鰓中id1基因及MTF1轉錄因子的表達變化，表明id1基因和mtf基因在鎘脅迫機體的應答過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。在各組織中不同的變化表明，鎘脅迫后各組織的應激反應有所差異，且id1基因及mtf基因的表達具有組織差異性。在肝臟中，id1基因及mtf基因同時上調表

8、明，id1基因的上調或許和mtf基因的高表達相關。
　　2.雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗表明，id1基因可能部分受到MTF1因子的調節(jié)，并且MTF1對id1基因的影響呈現低促高抑的趨勢。對id1啟動子上金屬應答元件（MRE）的突變實驗表明，各MRE元件對id1啟動子活性的貢獻不同。
　　3.斑馬魚id1啟動子體內外活性分析結果表明，id1啟動子活性隨長度變化不同表現各異，說明啟動子上存在眾多順式調控元件。體內外活性趨勢的差異表明，