認(rèn)知侵襲性真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

1、認(rèn)知侵襲性真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷,匯報(bào)人 楊燁建,何為侵襲性真菌感染?,DFI（deep fungal infection）,真菌侵犯毛發(fā)、表皮、甲床以外的組織（皮下組織、黏膜、肌肉、內(nèi)臟器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等）引起的感染。,DFI中急、危、重者。真菌在組織器官或血液中生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織器官損傷，常伴多器官功能障礙。,IFI（invasive fungal infection）,2007年歐洲癌癥治療研究組織(EORTC)侵襲性

2、真菌感染協(xié)作組(IFICG)和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所霉菌病研究組(NIAID-MSG)將IFI改稱IFD。國(guó)內(nèi)未獲響應(yīng)，現(xiàn)僅用于侵襲性念珠菌病(invasive candidosis,IC)和曲霉病(invasive aspergillosis,IA)。,IFD（invasive fungal disease）,IFI診斷依據(jù),EORTC和NIAID/MSG 2007年修訂標(biāo)準(zhǔn),國(guó)內(nèi)各學(xué)會(huì)診治指南。IFI診斷分級(jí)： 擬診（po

3、ssible） 臨床診斷（probable） 確診（proven）,IFI診斷依據(jù),IFI分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn),（1）血液真菌培養(yǎng)陽(yáng)性，但曲霉、青霉（馬爾尼菲青霉除外）需排除污染。（2）導(dǎo)管相關(guān)性真菌血癥，導(dǎo)管培養(yǎng)與血培養(yǎng)均陽(yáng)性，且為同一真菌。（3）胸水真菌培養(yǎng)陽(yáng)性。（4）肺組織真菌培養(yǎng)陽(yáng)性。（5）合格痰標(biāo)本或BALF鏡檢發(fā)現(xiàn)肺孢子菌包囊、滋養(yǎng)體或囊內(nèi)小體。（6）胸水、CSF、血液直接鏡檢發(fā)現(xiàn)新生隱球菌。（7）直接導(dǎo)尿培養(yǎng)念珠菌

4、>105CFU/ml。,有確診價(jià)值的微生物學(xué)檢查,常見(jiàn)IFI病原的診斷,以下列念珠菌屬最常見(jiàn): 白色—（C.albicans）、光滑—（C.glabrata）、 熱帶—（C.tropicalis）、近平滑—（C.parapsilosis）、克柔—（C.krusei）、都柏林—（C.dubliniensis）、季也蒙—（C.guilliermondii）。 北京大學(xué)人民醫(yī)院血液科(2004.4~2005.2間)165株念

5、珠菌，其中： 白念78.8%，其他念珠菌21.2%； 張紅金等2006.1~6月ICU患者并發(fā)IFI 137例，其中： 白念65株（47.4%）、光滑36株（26.3%）、熱帶28株（20.4%）、平滑5株（3.6%）、克柔2株（1.5%）、青霉1株（0.7%）。,常見(jiàn)IFI病原（1）念珠菌屬（Candida）,單因素分析: 念珠菌定植、WBC＜0.5×109/L持續(xù)＞10d、使用碳青霉烯類抗生素是

6、惡性血液病患者發(fā)生IC的危險(xiǎn)因素；多因素分析: WBC＜0.5×109/L持續(xù)＞10d是IC唯一危險(xiǎn)因素。,IC發(fā)病的重要前提是念珠菌定植,（1）革蘭染色、乳酸酚棉藍(lán)染色，鏡檢4~6μm圓或卵圓芽胞，可見(jiàn)出芽，假菌絲。 ?用含熒光增白劑（Calcofluor White ，CFW）的10%~20% KOH涂片，紫外線激發(fā)呈藍(lán)白或綠色熒光。（2） 培養(yǎng)于沙氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)乳白色酵母樣菌落； ?玉米粉-Tw

7、een80瓊脂生長(zhǎng)假菌絲、厚壁孢子； ? CHROMagar培基上（35℃）菌落呈色：白念-綠色，熱帶-藍(lán)灰，粉紅、邊緣模糊-克柔。 ?其他種為白色至粉紅色。血清（雞蛋清）中37℃ 2~3h白念產(chǎn)生芽管。 ?種間鑒別用糖發(fā)酵和糖同化試驗(yàn)。,常規(guī)檢查,（1）測(cè)抗原 胞壁1,3-β-D-葡聚糖（G試驗(yàn)），表面抗原甘露聚糖（LA試驗(yàn)），熱不穩(wěn)定蛋白（LA試驗(yàn)），胞漿蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr

8、65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）測(cè)抗體 烯醇化酶（P47）抗體（ELISA），白念珠菌芽管抗體（CAGTA）間接免疫熒光法。,血清學(xué)試驗(yàn),（1）以ITSI（internal transcribed spacer 1，內(nèi)部可轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1）為靶基因的泛真菌PCR加DNA測(cè)序法（可測(cè)念珠菌、隱球菌、曲霉、鐮刀菌等多種真菌）。（2）泛曲霉念珠菌檢測(cè)法（pan-AC assay）用種特異探計(jì)real-timePCR（常見(jiàn)的6種

9、念珠菌、9種曲霉）。（3）以28SrDNA為靶基因的real-timePCR?？蓽y(cè)念珠菌、曲霉、隱球菌、毛霉、青霉等。（4）多串連PCR（multiplex tandem PCR，MT-PCR）以ITS1、ITS2、EF1-α、β微管蛋白（β-tubulin）為靶基因，可測(cè)常見(jiàn)念珠菌、隱球菌、曲霉、鐮刀菌、接合菌等。（5）反向線點(diǎn)雜交（reverse line blot hybridization，RLB）和基因芯片（oligon

10、ucleotide microarray）技術(shù)。尚未獲批準(zhǔn)。,分子生物學(xué)診斷,185個(gè)種中有20多個(gè)可致機(jī)會(huì)性感染 常見(jiàn)為: 煙曲霉（A.fumigatus）、黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）。 棒曲霉（A.clavatus）、灰綠曲霉（A.glaucus）、構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、雜色曲霉（A.versicolor）

11、也有報(bào)告。,常見(jiàn)IFI病原（2）曲霉菌屬（Aspergillus）,曲霉菌孢子是鏈狀的，成熟后脫落，2~5μm，易在空氣中懸浮。經(jīng)空氣吸入孢子致病，與定植無(wú)關(guān)。,曲霉鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征,血清學(xué)試驗(yàn)：G試驗(yàn)，GM試驗(yàn)。 分子生物學(xué)診斷：同念珠菌屬。,包括: 菌落顏色，分生孢子梗形態(tài)、顏色，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)數(shù)目，頂囊形態(tài)等。 煙曲霉耐高溫，40℃（38.5~50℃）生長(zhǎng)良好。,約78個(gè)種，致病的約17個(gè)種和8個(gè)變種，引起IFI的主要

12、為: --- 新生隱球菌（C.neoformans）， --- 有新生變種（var.neoformans）（血清型D型）， --- 格特變種（var.gatii）（B、C型）， --- grubii變種（var.grubii）（A型）。在A、B、C、D、AD血清型中，我國(guó)已見(jiàn)A、D及AD型，A型最多。,常見(jiàn)IFI病原（3）隱球菌屬（Cryptococcus）,感

13、染途徑：經(jīng)呼吸道吸入孢子（可從鴿糞、按樹(shù)分離），侵犯肺與神經(jīng)系統(tǒng)。鑒定要點(diǎn)：沙氏培養(yǎng)基25℃~37℃均生長(zhǎng)。CSF直接或離心沉淀物涂片墨汁染色發(fā)現(xiàn)圓或橢圓雙層厚壁孢子，外有寬莢膜。菌體可見(jiàn)單個(gè)出芽。,血清學(xué)試驗(yàn)： 隱球菌莢菌多糖抗原膠乳凝集試驗(yàn)(LA),試劑盒法國(guó)PaxtorexTM Crypto Plus,紅色膠乳顆粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)單抗。 標(biāo)本：血清、CSF、BALF、尿，血清和CSF用鏈霉蛋白酶56℃

14、、30min預(yù)處理。 假陽(yáng)性：RF>500IU/ml時(shí)(9/26)；TB患者血清(2/26)。1:4稀釋轉(zhuǎn)陰。ELISA法： 多抗包被，酶標(biāo)記單抗檢測(cè)。不受RF干擾。分子生物學(xué)診斷： 同念珠菌屬。,,組織病理中的隱球菌（PAS）,墨汁染色中的隱球菌,隱球菌性腦膜炎診斷,腦脊液檢查墨汁涂片培養(yǎng)動(dòng)物接種電鏡觀察莢膜抗原乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）分子生物學(xué)的方法涂片和培養(yǎng)對(duì)于診斷具有決定意義,直接墨汁涂片,陽(yáng)性率大約

15、為60%優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)便、可做菌體計(jì)數(shù)當(dāng)腦脊液中的菌體數(shù)較少 （低于103/mm3 ）常常會(huì)有假陰性結(jié)果，需要做進(jìn)一步的檢查,真菌培養(yǎng),對(duì)本病的診斷有決定意義，是確診的金標(biāo)準(zhǔn)診斷的敏感性高于直接真菌涂片腦脊液真菌培養(yǎng)的方法，對(duì)于培養(yǎng)的結(jié)果具有重要的影響,莢膜抗原乳膠凝集實(shí)驗(yàn)（LAT）,LAT是以高效價(jià)的抗隱球菌莢膜多糖抗體吸附于標(biāo)準(zhǔn)大小的乳膠上，檢測(cè)血清或CSF標(biāo)本中的隱球菌莢膜抗原。特異性接近100%，敏感性約為95%與菌

16、體計(jì)數(shù)具有平行性，對(duì)于預(yù)后判斷有幫助,屬真菌界，子囊菌門，古子囊菌綱，肺孢子菌目，肺孢子菌科，肺孢子菌屬。1909年Chagas首先發(fā)現(xiàn)（克氏錐蟲），至上世紀(jì)80年代一直歸為原蟲（真菌培養(yǎng)基不生長(zhǎng)；細(xì)胞膜無(wú)麥角固醇，對(duì)麥角醇合成抑制劑類抗真菌藥耐藥，但對(duì)抗原蟲藥敏感）。,常見(jiàn)IFI病原（4）卡氏肺孢子菌（Pneumocystis carinii）,直接鏡檢： 痰（30%）、BALF（75%）、經(jīng)皮穿刺肺活檢（60%）、開(kāi)胸

17、肺活檢（95%）查找包囊等。染色法：Gomori’s環(huán)六亞甲基四胺銀（GMS），亞甲胺藍(lán)、熒光素染色（染包囊壁和囊壁括弧樣結(jié)構(gòu)）。培養(yǎng)： Uero、CEI、WI-38、MRC-5和Chang肝細(xì)胞等。,血清學(xué)試驗(yàn)： 查抗原：熒光素標(biāo)記單抗測(cè)標(biāo)本中包囊、滋養(yǎng)體，陽(yáng)性率97%~99%。 查抗體：ELISA、IIF、WB查抗體，陽(yáng)性率50%~ 90%，假陽(yáng)性率高。WB法測(cè)抗Mr 35000~45000抗體，提示活動(dòng)感染。

18、分子生物學(xué)診斷： 同念珠菌屬。,無(wú)性型在孢子囊內(nèi)形成不能游動(dòng)的靜孢子，有性型形成接合孢子。毛霉目（Mucorales）、蟲霉目（Entomophthorales）中部分種可致毛霉?。╩ucormycosis）或接合菌病（zygomycosis）。,常見(jiàn)IFI病原（5）接合菌（Zygomycetes）,毛霉屬（Mucor）、根霉屬（Rhizopus）、犁頭霉屬（Absidia）、根毛霉屬（Mucor Rhizomucor）、被

19、孢霉屬（Mortierella）、共頭霉屬（Sycephalastrum）、小克銀漢霉屬（Cunninghamella）、瓶霉屬（Saksenaea）等致病的種多。吸入孢子、創(chuàng)傷感染、食入污染食物致病。特點(diǎn)是菌絲侵犯血管，引起栓塞、組織壞死、化膿性反應(yīng)和肉芽腫。最常播散至腦，鼻竇炎、眶窩織炎、肺炎。鼻腦毛霉病占30%~50%，病死率80%~90%，次為肺、胃、腸毛霉病。,毛霉目中有7個(gè)科、12屬、24種致病,直接鏡檢標(biāo)本中見(jiàn)90&

20、#176;角分支的寬大、透明、無(wú)分隔或極少分隔菌絲可診斷。確診須從組織切片中找到菌絲。蟲霉目中1科、2屬、3種致病： 蛙糞霉屬(Basidiobolus)中的固孢蛙糞霉(B.haptasporus)，耳霉屬(Conidiobolus)中的冠狀耳霉(C.coronatus)和異孢耳霉(C.incongruus)。傳入途徑: 微小外傷，昆蟲叮咬。,直接鏡檢標(biāo)本中寬大、不規(guī)則，無(wú)分隔的薄壁真菌菌絲及其片段。分子生物學(xué)診斷：同念珠菌

21、屬。,25℃菌絲相、37℃酵母相的致病真菌包括申克孢子絲菌，馬爾尼菲青霉、莢膜組織胞漿菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌等。有的有地域分布特點(diǎn)；對(duì)人致病力強(qiáng)，感染無(wú)須免疫受損。,常見(jiàn)IFI病原（6）雙相型真菌,申克氏孢子絲菌鏡下特征,纖細(xì)分支分隔菌絲直角分枝的分生孢子梗，頂端梨形或圓形小分生孢子，呈“梅花瓣樣”結(jié)構(gòu)有的小分生孢子沿菌絲兩側(cè)排列，呈“袖套狀” 酵母相鏡下可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性卵圓形或梭形孢子,,,自然界土壤、竹筍

22、、甘蔗中（25℃）多以菌絲形式存在，組織中形成酵母樣細(xì)胞，兩端鈍圓，有橫隔。竹鼠為帶菌動(dòng)物。吸入本菌孢子或食入霉變甘蔗發(fā)病。侵犯單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，全身重要臟器均可受累。所致IFI 70%見(jiàn)于AIDS患者。,馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei）,骨髓、外周血涂片，皮膚、淋巴結(jié)活檢組織涂（切）片，潰瘍分泌物涂片，巨噬細(xì)胞內(nèi)外直徑2~3μm，有1~3個(gè)橫隔的橢圓（臘腸）形細(xì)胞。糖原染色可與黑熱病LD小體和莢膜組織胞漿

23、菌鑒別。培養(yǎng)陽(yáng)性為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性率骨髓100%，皮損90%，血液76%。血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)Mp1基因編碼的本菌特異的胞壁甘露糖蛋白Mp1P抗原或其特異抗體。分子生物學(xué)診斷：同念珠菌飛行屬。,馬爾尼菲青霉鑒定依據(jù),雙相菌直接或病理檢查找到臘腸形孢子 菌落特征（培養(yǎng)基被染成紅色）和鏡下結(jié)構(gòu)（帚狀枝及孢間連體）在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良（麥芽汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好）,菌絲相,酵母相,菌絲相(正面),菌絲相(反面),馬爾尼菲青霉,臘腸形孢子,

24、某些種與大骨節(jié)病、克山病、食管癌有關(guān)，在真菌性角膜炎中占58.7%?？芍滦?、腦、肺感染和真菌血癥。引起的IFI逐年增多，發(fā)病率、死亡率僅次于白念珠菌和曲霉所致感染。吸入本菌致肺感染，類似IA。侵犯血管引起血栓致組織壞死。,常見(jiàn)IFI病原（7）鐮刀菌屬（Fusarium）,特征：典型鐮刀形大分生孢子，大、小不等，有2～5個(gè)分隔。但即使多次分離出同一真菌也只能是疑診。確診：培養(yǎng)陽(yáng)性，病理組織切片發(fā)現(xiàn)本菌。,介紹兩個(gè)實(shí)驗(yàn),GM試驗(yàn)

25、 G試驗(yàn),GM試驗(yàn) 檢測(cè)曲霉半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原。 試劑盒：Bio-Rad公司 PLATELIATM Aspergillus EIA. 原理： 一步酶免疫夾心微孔板法……,（1）GM連續(xù)2次陽(yáng)性 有臨床診斷價(jià)值。（2）GM陰性不能排除IA（GM低于可測(cè)限）；高?；颊邞?yīng)每周2次篩查。（3）A值<0.000提示操作、試劑、儀器有誤，應(yīng)復(fù)測(cè)。（4）假陰性：見(jiàn)于慢性肉芽腫病，Job

26、’s綜合征及某些用抗真菌藥治療的IA患者。,結(jié)果解釋：,（5）假陽(yáng)性： ①青霉屬（Penicillium）、交鏈孢屬（Alternaria）、擬青霉屬（Percilomyces）、地絲菌屬（Geotrichum），組織胞漿菌屬（Histoplasma）真菌與EBA-2單抗有交叉反應(yīng)。 ②某些谷類制品、乳脂點(diǎn)心中含半乳呋喃糖（galactofuranose），牛奶制品（humanized milks）含高濃度GM

27、，常在嬰兒造成GM假陽(yáng)性。 ③某些批次半合成β內(nèi)酰胺抗生素（piperacillin/tazobactam，amoxicillin與clavulanic acid）中含GM抗原。（6）GM試驗(yàn)對(duì)中性粒細(xì)胞減少癥IA患者診斷價(jià)值較高，對(duì)非中性粒細(xì)胞減少的IA診斷價(jià)值較差。,G試驗(yàn)： 檢測(cè)真菌(念珠菌、曲霉、肺孢子菌等)壁1,3-β-D葡聚糖(glucan). 適用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮孢霉等引起的感染。 試劑盒

28、: Glucatell (美國(guó)Cape Code公司), 2003年美國(guó)FDA批準(zhǔn), 美洲鱟: 界值60pg/ml。 Fungitec.G(日本Seikagaku Kogyo公司),東方鱟: 界值20pg/ml。 Goldstream(北京金山川公司): 界值20pg/ml。,試驗(yàn)原理 類似檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試驗(yàn)(limulus lysate test),細(xì)菌內(nèi)毒素/1,3-β-D-glucan激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的凝

29、固酶原，生成凝固蛋白，引起濁度/色度變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢樣中1,3-β-D-glucan含量。,參考值 20pg/ml IFI（不能區(qū)分真菌種屬） ? 以≥50pg/ml為陽(yáng)性, 診斷IFI敏感性63.6%, 特異性90.8%. ? Cut off值, 敏感性, 特異性尚待大規(guī)模臨床驗(yàn)證。,1、真菌感染檢查知識(shí)普及，人才培訓(xùn)。2、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的商品試劑盒供應(yīng)。3、產(chǎn)、學(xué)、研結(jié)合，研發(fā)驗(yàn)證新方法、新試劑。,幾點(diǎn)

30、建議,IC和IA的相關(guān)血清學(xué)研究,分離提取白念珠菌烯醇化酶基因工程制備白念珠菌烯醇化酶動(dòng)物模型考察侵襲性白念珠菌感染后抗體產(chǎn)生規(guī)律制備烯醇化酶單克隆和多克隆抗體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選煙曲霉優(yōu)勢(shì)抗原巢式PCR技術(shù)檢測(cè)煙曲霉DNA用煙曲霉分泌蛋白檢測(cè)侵襲性曲霉病人以及疾病模型動(dòng)物抗體，評(píng)估診斷價(jià)值。,展望,血清學(xué)方法有益于IC的早期診斷；目前市場(chǎng)提供診斷試劑品種少，檢測(cè)的敏感性、特異性尚不能滿足需要；解決IC早期快速診斷問(wèn)題任重