醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗

1、,,醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術,國家食品藥品監(jiān)督管理局北京醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗中心,,,醫(yī)療器械無菌檢驗技術,,什么是無菌檢查法？,用于檢查要求無菌的醫(yī)療器械是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現微生物污染。 無菌試驗的目的：將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培養(yǎng)基內，以檢驗供試品是否有細菌和真菌污染。,醫(yī)療器械無菌檢驗標準,,GB/T 14233.2 -2005 醫(yī)用輸液、輸血、

2、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學試驗方法2010年版《中國藥典》無菌檢查法,醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）,,,無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產品生產控制過程中的一項重要內容。其檢驗方法、檢驗結果判定及檢驗人員業(yè)務能力等因素直接影響產品的質量和安全。作為無菌醫(yī)療器械生產企業(yè)，其無菌檢驗工作應由本企業(yè)獨立完成。并要求企業(yè)的檢驗人員能當場操作或口述無菌檢驗的過程。,,,,滅菌: 殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國

3、際上規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。 微生物: 必須用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的微小生物。微生物具有一定的形態(tài)與結構,并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長和繁殖,如細菌、病毒、真菌等。 無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。 無菌技術:是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施，其中包括無菌環(huán)境設施、無菌試驗器材以及無菌操作。,,

4、,,無菌操作:是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。 培養(yǎng)條件：用于促進微生物發(fā)育、生長和繁殖的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。 抑細菌/抑霉菌試驗：用選定的微生物來演示某些物質的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。 培養(yǎng)基: 是人工配制的生物營養(yǎng)物質，即用人工的方法將多種物質按各種微生物生長繁殖的需要配成的一種混合營養(yǎng)物。,,,,促生長試驗：用于證明生長培養(yǎng)基

5、能夠支持微生物 生長的技術操作。 假陰性：實際陽性的無菌試驗結果被變成了陰性。 假陽性：實際陰性的無菌試驗結果被變成了陽性。 需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。 厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才能生存的微生物。 無菌保證水平（SAL）:滅菌后產品上存在單個活微生物的概率。,,,,細菌：為單細胞微生物,其細胞分化不完善，

6、無完整細胞核及核膜、核仁，直徑一般為1μm ~ 10μm。,,,,真菌：為多細胞或單細胞微生物，其細胞分化完善，有細胞核和各種細胞器，故易在體外生長繁殖，直徑一般為10μm ~ 100μm。,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,,,超凈工作臺,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,,,恒溫培養(yǎng)箱（至少2臺）,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,,,壓力蒸汽滅菌器,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,,,電熱干燥箱,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,集菌儀,,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,,

7、,生物安全柜:（從試驗安全性考慮，建議陽性對照試驗使用生物安全柜）,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,電子天平,,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,光學顯微鏡,,醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備,過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）,,無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10 000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及

8、環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關的要求進行驗證，其內部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經過無菌技術的培訓。還應該具有高度的責任心和嚴謹細致的工作作風。,環(huán)境及人員要求,,,,,,,無菌檢查法 環(huán)境要求,,,,,隔離系統(tǒng),無菌檢查法 環(huán)境要求,,,,,無菌室在消毒處理完畢后，應檢查空氣中的菌落數。,無

9、菌檢查法 環(huán)境要求,TSA瓊脂平皿在30℃~ 35℃培養(yǎng)48h證明無菌,取3只放無菌操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露30min后蓋好,3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數平均應不超過1個,無菌試驗過程中也應檢查空氣中的菌落數，方法要求同上,,,無菌檢查法 試驗前準備,,器具滅菌：與供試液接觸的所有器具應采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內121℃30min，或置電熱干燥箱內160℃2h。 培養(yǎng)基：可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，

10、亦可使用按該處方生產的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在2 ℃ ~ 25℃，一般在3周內使用。,無菌檢查法 試驗前準備,配制培養(yǎng)基所需器具:,,,,,,無菌檢查法 試驗前準備,常用器具與稀釋液:,,,,,,無菌檢查法 試驗前準備,培養(yǎng)基:,,,,,,無菌檢查法 試驗前準備,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基: 在供試品接種前, 培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則,須經100℃

11、水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻,只限加熱一次，并應防止被污染。其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培養(yǎng)14天。,,,,,,需氧菌生長,厭氧菌生長,,,無菌檢查法 試驗前準備,,,,,,,100℃水浴加熱,無菌檢查法 試驗前準備,培養(yǎng)基:,,,,,,無菌檢查法 試驗前準備,改良馬丁培養(yǎng)基： 23℃ ~ 28℃培養(yǎng)14天,,,,,,無菌檢查法 試

12、驗前準備,培養(yǎng)基:,,,,,,無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。        無菌性檢查    每批培養(yǎng)基隨機不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,靈敏度檢查：     

13、;                                    &#

14、160;       菌種   培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus   aureus)［CMCC（B） 26 003］ 銅綠假單胞菌&

15、#160;   (Pseudomonas  aeruginosa) ［CMCC（B） 10  104］ 枯草芽孢桿菌    (Bacillus  subtilis )             

16、60;  ［CMCC（B） 63  501］ 生孢梭菌         (Clostridiumsporogenes)            [CMCC(B)  

17、60;      64  941] 白色念珠菌       (Candidaalbicans)                 

18、      [CMCC(F)         98   001]　 黑曲霉           (Aspergillus   niger&

19、#160; )　　　　   [CMCC(F)         98   003],培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,菌液制備：                

20、                                   接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單

21、胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（24～48）小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL 含菌數小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,菌液制備：接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面

22、培養(yǎng)基上，（23～28）℃培養(yǎng)（5～7）天，加入（3～5）mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL 含孢子數小于100cfu的孢子懸液。 菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在（2～8）℃可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗證過的貯存期內使

23、用 。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線（3-4）條，再轉動培養(yǎng)皿70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,,平板劃線法-曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。,,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,血

24、瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）,在劃線過程中，細胞逐漸分散，培養(yǎng)后可形成單個菌落。,定期移植法:亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于(4～6)℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。 操作步驟： 斜面制備 接種 培養(yǎng) 保藏,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,,,,接 種,,,

25、,,,培養(yǎng)基應符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。,靈敏度檢查所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉,分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（12mL）9支：分別接種小于100cfu的金葡、銅綠、枯草、生孢各2支，

26、另一支不接種做空白對照，培養(yǎng)3天,改良馬丁培養(yǎng)基（9mL） 5支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接種做空白對照，培養(yǎng)5天,逐日觀察結果：空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，則靈敏度符合規(guī)定。,,,,,,,,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,對起始樣品進行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內部菌落呈豆

27、狀或透鏡狀。,,培養(yǎng)基的適用性檢查,,,,,,無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法直接接種法:將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內培養(yǎng)。薄膜過濾法:含抗菌、抑菌成分的供試品會抑制某些微生物的生長繁殖,所以用常規(guī)方法檢查會出現假陰性的結果, 但并不等于產品中沒有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜過濾法來去除供試品中可溶的抑菌性成分,把細菌等微生物截留在濾膜上,然后再經過處理培養(yǎng)使所含微生物生長繁殖, 從而使微生物檢

28、出。,方法驗證試驗,,,,,,當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。      驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。,方法驗證試驗,,,,,,菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)

29、4 4102〕外，金黃色葡萄球菌 、 枯草芽孢桿菌  、 生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。 方法驗證試驗與靈敏度檢驗所有菌種區(qū)別：大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。,方法驗證試驗,,,,,,取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫

30、乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或將培養(yǎng)基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3天~ 5天。各試驗菌同法操作。,方法驗證試驗：薄膜過濾法,,,,,,,方法驗證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉,分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液（濃度小于100cfu/mL）,硫

31、乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)3天。,改良馬丁培養(yǎng)基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)5天。,,,,,,方法驗證試驗：直接接種法,與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略

32、不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用中和劑或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。    方法驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。,方法驗證試驗：結果判斷,,,,,,供試品數量的選擇： 檢驗數量是指一次試驗

33、所用供試品最小包裝容器的數量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1 支（或瓶）作陽性對照用。,供試品的無菌檢查,,,,檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部

34、內容物過濾。,供試品的無菌檢查,,,,供試品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。 操作人員準備：帶口罩、帽子、穿專用無菌服、鞋進入無菌室。,供試品的無菌檢查,,,,,供試品的無菌檢查,,,在100級超凈臺內，酒精燈火焰周圍，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不少于15m

35、l/管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少于10ml/管）的容器中。 正確的無菌操作，既不能引入外來菌污染培養(yǎng)物造成假陽性，也要注意接觸供試品的試驗用具溫度不可過高以免將可能存在的菌燙死。,,陰性對照（目的是驗證試驗是否存在污染） ：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。陽性對照（目的是驗證試驗可靠性，防止假陰性）：應根據供試品特性選擇陽性對照菌；無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。

36、陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)(48 ~ 72)小時應生長良好。,供試品的無菌檢查,,,,,,無菌檢查法-直接接種法,,供試品數量：同一批號3個~ 11個單位供試品 優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內培養(yǎng)。如：棉簽、導尿包中的導尿管、注射器中的液體等,無菌檢查法 –直接接種法,,不適宜直接投放的可制備供試液：

37、浸提介質：9g/L無菌氯化鈉溶液（生理鹽水）、0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 、根據供試品的特性，可選用其他驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。管類器具： 按管內表面積每10cm2流過管內腔1mL浸提介質，流量約為10mL/min。容器類器具： 已有液體的直接取液；空容器每10cm2加入浸提介質1mL，振搖數次。實體類器具：表面積每10cm2加入浸提介質1mL，振搖數次。

38、 供試液制備應按無菌操作法進行，在制備后2h內使用。,無菌檢查法 –直接接種法,直接接種法：每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。,,,無菌檢查法-薄膜過濾法,2010年版《中國藥典》規(guī)定:只要供試品性狀允許，應采用薄

39、膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。 在蠕動泵的作用下，被測產品通過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，免去了通常膜轉移過程中易產生的污染。 無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應不大于0.45μm，直徑約為50mm。,,水溶液供試品,取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。,供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾

40、膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過1000mL，以免濾膜上微生物受損傷。,無菌檢查法-薄膜過濾法,,,,沖洗后分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應的濾筒內，培養(yǎng)。,無菌檢查法 培養(yǎng)及觀察,,上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培

41、養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。,若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。 試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品

42、不符合規(guī)定。,陽性對照管應生長良好，陰性對照不得有菌生長。否則，試驗無效。,無菌檢查法 結果判斷,,當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結果無效：       （1）無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求；      （2）回顧無菌試驗過程，發(fā)現有可能引起微生物污染的因素。&

43、#160;           （3）供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。,無菌檢查法 結果判斷,試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。,無菌檢查法 結果判斷,醫(yī)療器械無菌試驗檢查

44、要點指南（2010版）,,,由于無菌檢驗時間跨度較長，因此過程的記錄應能夠完整體現試驗的全過程，對于在試驗過程中出現的各種情況，均應在記錄中客觀反映。,直接接種法試驗結果,,,薄膜過濾法試驗結果,,,無菌檢查法 判定,,,,試驗報告中宜給出下列信息： 供試品名稱；生產批號和（或）滅菌批號；供試液制備方法；接種方式；每日觀察結果（包括陰、陽性對照）；結果判定,試驗報告,（1）培養(yǎng)基配制記錄（2）滅菌器、天平等儀器的使用記錄

45、（3）培養(yǎng)基無菌性檢查、靈敏度檢查記錄（4）菌種購買、傳代、使用記錄（5）方法學驗證記錄（6）無菌試驗記錄（7）滅菌物品制作（8）廢棄物處理記錄（9）潔凈間監(jiān)測記錄,醫(yī)療器械無菌檢驗應有記錄,一、適用范圍 二、檢查內容1.選擇的無菌檢驗方法 2.檢驗人員 資質3.現場察看無菌實驗室環(huán)境4.設備和器具 5.管理制度、操作規(guī)程等相關技術文件 6. 查閱試驗記錄 三、其它應注意的問題,醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點

46、指南（2010版）,（1）培養(yǎng)基制備 （2）供試品的無菌檢查 （3）培養(yǎng)及觀察 （4）結果判斷,（1）樣品記錄 （2）滅菌物品制作記錄 （3）原始試驗記錄 （4）廢棄物處理記錄,,,醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）,,,其它應注意的問題還包括： 生產企業(yè)應確保樣品具有代表性：試驗樣品應從常規(guī)產品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機的。試驗樣品的選擇和處理技術應明確，以免對樣品上所含的微生物的數量

47、和種類造成污染和改變。試驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產品，它們應該代表這個生產批的加工程序和條件。用于試驗的不合格產品應不會影響無菌測試的有效性。,醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南（2010版）,,,其它應注意的問題還包括： 生產企業(yè)對于供試品的選取、轉移過程要采取防止污染措施，確保試驗結果的可靠性。選取制作供試品的試驗樣品時，樣品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將

48、外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。,無菌試驗要點,器具滅菌：所有器具高壓滅菌121℃30min，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基: 接種前, 培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，30℃ ~ 35℃培養(yǎng)14天。改良馬丁培養(yǎng)基： 23℃ ~ 28℃培養(yǎng)14天。兩種培養(yǎng)基要符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求；,無菌試驗要點,供試品包裝完好。培養(yǎng)基、供試品消毒后帶入無菌室。采用驗證過檢查方法（直接接種法或薄膜過濾

49、法）在潔凈度10 000級下的局部100級區(qū)域內，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品或供試液分別接種至兩種培養(yǎng)基中，同時做陰性對照和陽性對照；按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。逐日觀察并記錄。如在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。,無菌試驗要點,陽性對照管應生長良好

50、，陰性對照不得有菌生長。供試品管均應澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。 出具試驗結果后，所有培養(yǎng)物121℃高壓滅菌30分鐘處理。 做好相應試驗記錄。,實例：薄膜過濾法——考察沖洗量 試驗菌： (1)生孢梭菌64941 (2)銅綠假單胞菌101

51、04 (3)枯草芽孢桿菌 63501 (4) 金黃色葡萄球菌26003總取樣量：15g / 每株試驗菌,,,+:對照管;　 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml; 3:沖洗液體積400ml.35℃,培養(yǎng)24小時.,+:對照管;　 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml.35℃,培養(yǎng)48小時.,結論

52、:,1.紅霉素對生孢梭菌生長無抑制作用.2.紅霉素對銅綠假單孢菌生長無抑制作用.,＋ :對照管;　 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml; 3:沖洗液體積400ml.35℃,培養(yǎng)72小時.,1.紅霉素對枯草芽孢桿菌有抑制作用.每筒加樣量5g(相當于紅霉素25mg)。2. 沖洗液體積400ml,枯草芽孢桿菌48小時后可見微弱生長,72小時生長良好。3. 在該檢驗條件下,沖洗400ml,三天內可檢出枯草芽

53、孢桿菌.,結論:,,,+:對照管;　 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml;3:沖洗液體積400ml.35℃,培養(yǎng)72小時.,,500:沖洗液體積500ml; 700:沖洗液體積700ml.35℃,培養(yǎng)72小時.,結論:,1.紅霉素對金黃色葡萄球菌有抑制作用。2.在該檢驗條件下,沖洗700ml,殘留的紅霉素不影響金黃色葡萄球菌的生長。,,,醫(yī)療器械初始污染菌檢驗技術,GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)

54、生用品衛(wèi)生標準,初始污染菌的檢驗,初始污染菌：產品消毒、滅菌前的細菌總數，可判明檢品受細菌污染的程度以及生產單位所用的原料、工具設備、工藝流程、生產人員的衛(wèi)生狀況，是對檢品進行衛(wèi)生學評價的綜合依據。,GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準 初始污染菌：產品消毒、滅菌前的細菌總數，可判明檢品受細菌污染的程度以及生產單位所用的原料、工具設備、工藝流程、生產人員的衛(wèi)生狀況，是對檢品進行衛(wèi)生學評價的綜合依

55、據。 微生物限度檢查法：檢查非規(guī)定滅菌產品受微生物污染程度的方法。 消毒與滅菌的區(qū)別:消毒是殺滅清除傳播媒介上病原微生物。但不能殺死芽孢等全部微生物。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。,初始污染菌的檢驗,,,初始污染菌的檢驗,,部分一次性使用衛(wèi)生產品微生物學指標要求,注：致病性化膿菌指綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。,初始污染菌的檢驗,準備：平皿洗凈、烘干；牛皮紙包好滅菌

56、 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制、滅菌。步驟：采樣，供試液制備，培養(yǎng)，菌落計數,在100級凈化條件下用無菌方法打開至少3個包裝； 從每個包裝中取樣，準確稱取10g±1g樣品；剪碎后加入200mL無菌生理鹽水中，充分混勻。 液體產品用原液直接做樣液。,初始污染菌的檢驗,,取上清液共接種5個平皿，每個平皿中加入1mL供試液,用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（15 ~ 20）mL，倒入每個平皿內混合均勻。,

57、待瓊脂凝固后翻轉平皿置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)48h后，計算平板上的菌落數。,稀釋度 5,,細菌菌落總數=5塊平板上的細菌菌落總數×（cfu/g或cfu/mL）,如：取10g樣品入200mL生理鹽水中，則稀釋20倍,當菌落數在100以內，按實有數報告，大于100時采用二位有效數字。,初始污染菌的檢驗,,計數方法：將平板置菌落計數器或從平板的背面直接以肉眼用標記筆點計，以投射光襯以暗色背景，仔細觀察，計數。必要時

58、可以借助于放大鏡、菌落計數器。菌落特征： ⑴形態(tài)特征：常為白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黃色。 ⑵邊緣整齊或不整齊，表面有光滑、粗糙，皺褶、突起或扁平。 ⑶大小差異很大。,初始污染菌的檢驗,,如果樣品菌落總數超過本標準的規(guī)定，應將留存的復檢樣品依前法復測2次， 2次結果平均值都達到本標準的規(guī)定，則判定被檢樣品合格；其中有任何一次結果平均值超過本標準的規(guī)定，則判定被檢樣品不合格。,大腸菌群檢測方法,樣液5m

59、L接種至50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h，如不產酸產氣，則大腸菌群為陰性。,如產酸產氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)18~24h，觀察平板上菌落形態(tài)。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，同時接種乳糖發(fā)酵管，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h，觀察產氣情況。,凡乳糖膽鹽發(fā)酵管產酸產氣，乳糖發(fā)酵管產酸產氣，在伊紅美藍平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌，可報告被檢樣品

60、檢出大腸桿菌。,乳糖膽鹽培養(yǎng)基中用的是溴甲酚紫作指示劑，該指示劑中性時呈藍紫色，酸性時呈黃色，大腸桿菌能分解乳糖產酸產氣，因此培養(yǎng)基變成黃色和產生氣泡。,綠膿桿菌檢測方法,樣液5mL接種至50mL SCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)(18~24)h，如有綠膿桿菌生長，表面呈現一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。,從培養(yǎng)液菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)

61、(18~24)h，觀察菌落特征。綠膿桿菌生長良好，其他菌不長。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，為陰性者需進行氧化酶、綠膿菌素、硝酸鹽還原產氣、明膠液化等一系列試驗。,金黃色葡萄球菌檢測方法,樣液5mL接種至50mL SCDLP培養(yǎng)液中，充分混勻， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h。,如有菌生長，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)(18~24)h，觀察菌落特征。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，為陽性呈葡萄狀，無芽

62、孢莢膜者，需進行甘露醇發(fā)酵、血漿凝固酶等一系列試驗。,溶血性鏈球菌檢測方法,樣液5mL接種至50mL葡萄糖肉湯中，充分混勻， 置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)24h。,如有菌生長，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置35 ℃±2 ℃培養(yǎng)18h~24h，觀察菌落特征。,取疑似菌落作革蘭氏染色鏡檢，如為陽性呈鏈狀排列的球菌，需進行鏈激酶桿菌肽敏感等一系列試驗。,真菌菌落總數檢測方法,若標準對真菌菌落總數有具體數值要求，則測試方法基本同細菌

63、菌落總數檢測方法，只是培養(yǎng)基采用沙氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25 ℃±2 ℃培養(yǎng)7天。,若標準要求真菌不得檢出，則取樣液5mL接種至50mL沙氏培養(yǎng)基中，25 ℃±2 ℃培養(yǎng)7天，逐日觀察有無真菌生長；若培養(yǎng)管渾濁應轉種沙氏瓊脂培養(yǎng)基，證實有真菌生長，可報告被檢樣品檢出真菌。,微生物學檢查,無菌檢查,微生物限度檢查,其他（初始污染菌）,細菌、真菌數量,控制菌（大腸、金葡、綠膿等）,,,,,醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗相