96孔微平板中含有3個重復的31種碳源biolog分析代謝指紋技術

1、膜磷脂脂肪酸圖譜分析 (Phospholipid Fatty Acid Profile) 代謝指紋技術 (群落水平生理特征圖譜Biolog)Metabolic fingerprinting techniques - Community level physiological profiles (CLPPs),微生物群落結構分析,膜磷脂脂肪酸分析,微生物特異磷脂脂肪酸,脂肪酸分子通式：X:YωZ（c/t）X：脂肪酸分子的總碳原

2、子數；Y：烯鍵的數目；ω：雙鍵的位置（從羧基端起計）; 后綴c和t分別表示順式和反式同分異構體,a (anto): 前異構甲基支鏈; cyc: 環(huán)丙基支鏈; i (iso): 異構甲基支鏈; Me:甲基支鏈,在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化,應用細胞中特異化學成分的前提,該物質僅存在于活的生物體中，在死亡微生物體或非生物的有機物質中量很小,磷脂脂肪酸僅存在于活細胞的細胞膜中，死亡細胞膜磷脂被迅速分解,容易從

3、細胞和土壤中提取出來；有測定該物質靈敏、準確的方法,PLFAs可從土壤中直接提取出來，并用氣相色譜測定其總量及種類,特定微生物具有特異性PLFAs，膜磷脂脂肪酸分析反映微生物群體的多樣性，可以用來測定微生物量中真菌和細菌比例,在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化,微生物PLFAs 組成隨環(huán)境及生理狀態(tài)而有所變化,膜磷脂脂肪酸總量與土壤微生物量(SIR法)的相關性,(Bååth & Ande

4、rson, 2003),真菌膜磷脂脂肪酸特異性,土壤中麥角甾醇(真菌組成指示物質)和18:2w6,9 PLFA含量之間的相關性 (Bååth & Anderson, 2003),,,提取測定土壤脂肪酸基本步驟,土壤樣本脂肪提取 氯仿:甲醇:緩沖溶液 = 1:2:0.8 (體積比),脂肪組分分離 通過硅酸柱將脂肪分為中性脂肪、糖脂和極性的磷脂3個組分,根據脂肪酸的飽和度、羧基數目及幾何特性等，區(qū)分不同種類的磷脂

5、脂肪酸,,,,,氣相色譜分析磷脂脂肪酸量,生物多樣性指標,豐度 生態(tài)系統中物種總數；Species EvennessDiversity index Shannon 指標Simpson 指標Berger-Parker指標Alpha指標,膜磷脂脂肪酸分析應用實例 - 土壤微生物中真菌細菌比例隨土壤pH變化,真菌細菌生物量系數 用18:2w6,9 PLFA 和13種細菌特有的PLFA 分別作為真菌和細菌的指示物 (B

6、29;åth & Anderson, 2003),定量描述微生物群落結構和生物多樣性；敏感地反映微生物群落結構變化較為簡單、有效微生物的PLFAs 組成隨環(huán)境及生理狀態(tài)而有所變化 大多數微生物細胞膜上占優(yōu)勢的脂肪酸組成很相 似，PLFAs分析不能鑒定微生物種類；是較為粗略的反映微生物群落結構和功能多樣性的參數，不能指示群落中單個菌種的變化,PLFAs方法評價,膜磷脂脂肪酸分析 （ Phospho

7、lipid Fatty Acids—PLFAs） 代謝指紋技術 (Biolog) Metabolic fingerprinting techniques- Community level physiological profiles (CLPPs）,微生物群落結構分析方法,根據微生物利用碳源特性，選擇含有不同碳源物質的微平板將土壤懸液接種于GN、GP、Ecoplate 微平板中，微平板中氧化還原染料形成的顏色

8、能指示微生物對不同碳源的利用程度Ecoplate平板：96孔微平板中含有3個重復的31種碳源,BIOLOG 分析代謝指紋技術-群落水平生理特征圖,微生物利用不同的碳源物質，產生電子傳遞體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)；四氮唑接受電子，轉變?yōu)樽仙募踪?(音同建）；顏色的深淺及形成速度，反映不同類型微生物的數量及活性,,Biolog 測定原理,BIOLOG－EcoPlateTM,EcoPlate碳源基質類型,10 g土壤＋90

9、 ml無菌水,4℃振蕩1 h（200 rpm / min）,取上清液用無菌水做成10-3的土壤稀釋液,吸取150 μl 接種至ECO板的微孔中,在Emax自動讀盤機上 每24 h 讀取一次590 nm 處光密度值，直至不再變化。,,,,,25 ℃ 下培養(yǎng)72h,BIOLOG 測定步驟,采用孔平均染色程度法(Average Well Color Development, AWCD ) 或曲線積分法(CI)，得出終點數據的標準轉換值，AWC

10、D或CI。AWCD=∑(C-R)/n C：每一個微孔的光密度值R：空白微孔的光密度值n ：碳源底物的數目(ECO板 n =31)根據培養(yǎng)時間計算每一個樣品的總平均AWCD值；應用主成分分析(PCA)比較不同的樣本,數據分析,箭頭所指的是土壤化學和物理性狀BD:容重; DP:入滲空隙; EC:電導率; AWC:有效水容量; N:氮; OMC: 有機質含量； SP：飽和率; PW:孔隙水,,土壤微生物群落結構以及物理

11、化學性狀受污水灌溉的影響,△ Waste water treated ○ control,主成份分析 土壤加入不同濃度的Hg培養(yǎng)一周后，在 31種單獨碳源基質上最大顯色速率; 主成份1和2分別解釋總變異的 41.1% 和17.4。(Müller et al., 2001. FEMS Microbiology Letters, 204, 49-53),應用實例- 微生物群落對土壤中Hg響應,主成份1,主成份2,優(yōu)點簡

12、單、快速，適用于大量樣品的測定尤其適合對于根際微生物群落結構的分析局限性 只適用于可培養(yǎng)的微生物 選擇性測定能利用簡單基質快速生長的微生物不適于森林土壤 常用的Ecoplate平板中碳源物質缺乏纖維素、半纖維素、木質素、幾丁質等森林土壤中常見的有機物質,Biolog 方法評價,基于16S rDNA 分析方法描述群落結構,基于PCR 16S rRNA分析,利用熒光染色顯微鏡鏡檢發(fā)現每克土壤或水體沉積物可含有1010 個細菌 而

13、利用瓊脂板分離到的細菌在森林土壤中僅占0.1-1%，在農田土壤中也不過10%；利用分子生物學技術可以分析包括不可培養(yǎng)的微生物在內的整個土壤微生物群落結構；,rDNA擴增及限制性位點分析(ARDRA),Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis 通過PCR擴增、克隆可探測到已知和未知的DNA序列，但每克土中有4000多種微生物，分析每個土壤樣本要測序幾千個序列，非常耗時，利用ARDRA提取

14、土樣中DNA;利用一定的標記引物(如熒光)對樣品中的DNA進行特異擴增；然后進行限制性內切酶酶解,獲得末端限制性片段TRFs；電泳分離片段，檢驗TRFs的多樣性；利用主成份分析比較不同樣本的末端限制性片段的特征,多聚酶鏈反應 - 變性或溫度梯度凝膠電泳技術 (PCR-DGGE/TGGE),Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis 使用1對特異性引物，利用PCR擴增微生

15、物自然群體的16S/18S rRNA基因;產生長度相同但序列不同的DNA片段的混合物，然后用DGGE分離；所得環(huán)境樣本的特異性DGGE條帶，經切膠，再進行PCR擴增特異性DNA片段直接測序或經DNA克隆、測序；進行系統發(fā)育分析，構建遺傳相似性圖譜，以揭示微生物多樣性演變的內在機制,CsCl/ethidium bromide 密度梯度平衡離心法分離同位素標記的DNAa: 從利用 12C- 或 13C-methanol 作惟一碳源純

16、培養(yǎng)的M. extorquens AM155 提取的DNA；b,c: 分離前后從加入12C- or 13C-methanol作惟一碳源的土壤中提取出的DNA Bar: 1cm (Radajewski et al., 2000 Nature 403, 646-649),穩(wěn)定同位素探針技術,從一系列單個基因組序列分析推斷它們在環(huán)境中相互作用,,,,Kowalchuk, 2005,測定特定環(huán)境基因組序列,,,,,,,,,,,,,,,,,,

17、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,并利用技術和試驗設計降低復雜程度…,生物多樣性指標,Alpha (a) 多樣性 特定區(qū)域、群落或生態(tài)系統中生物多樣性，一般用物種豐富度表示；Shannon 指數 H= -SPilnPi (i=1 to S) S: 物種數；Pi=ni/N:第i個物種個體(ni)占全部個體N比例。是communication entropySimpson 指數 D=1-SP

18、i2 (i=1 to S) Pi2= ni(ni-1)/[N(N-1)]; 0≧D ≦1, 接近1說明生物多樣性高，或環(huán)境空間異質性大，而近于0說明多樣性小,Beta β-diversity β = (S1 ? c) + (S2 ? c) S1,S2分別是兩個群落的物種數；c 在兩個群落中都有的物種數，可用來比較生態(tài)系統或表征環(huán)境梯度的影響； Sørensen‘s similar

19、ity index b=2c/(S1+S2),參考文獻,1) Firestone M., Balser T., Herman D.. Defining soil quality in terms of microbial community structure. Annual Reports of Research Projects, UC Berkeley, 1997 2) Garland J L., M

20、ills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community level sole carbon source utilization. Appl. Environment Microbiology, 1991, 57: 2351-2359 3)

21、 Garland J L..Analytical approaches to the characterization of samples of microbial communities patterns of potential C source utilization .soil biology biochemistry,1996,28:213~22 4) Muüller A. K., Rasmussen L.D

22、., SØrensen S. J. Adaptation of the bacterial community to mercury contamination. FEMS Microbiology Letters 2001, 204: 49-53 5) Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in thechar