分子生物學常用實驗

1、分子生物學,教師： 樊寶良,聯(lián)系方式：E-mail:fanbl119@vip.sina.com電話：7528476,主要學習內(nèi)容,緒論DNA的結(jié)構(gòu)DNA的生物合成RNA的生物合成蛋白質(zhì)的生物合成原核生物的基因表達調(diào)控真核生物的基因表達調(diào)控,Benjamin Lewin. Genes VI, Oxford Uni. Press, 1997 Weaver R. Molecular Biology. 科學出版社 2001 T

2、urner P.C. et al. Molecular Biology. 科學出版社 2001閻隆飛 張玉麟。 《分子生物學》，中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1997朱玉賢 李毅?！冬F(xiàn)代分子生物學》，高等教育出版社，1997李振剛。《分子遺傳學》，科學出版社，2000,,主要參考書目和重要網(wǎng)址,參考教材,英文原版,中文譯本,Lodish/berk et al.,STRYER et al Version 5,中國生物信息： http:/

3、/www.biosino.org/分子生物學信息網(wǎng) ：http://www.37c.com.cn生命科學商務網(wǎng)： http://www.e800b2b.com 生物軟件網(wǎng) http://www.bio-soft.net/ www.google.com中華基因網(wǎng)：http://www.chinagenenet.com/Celera Genomics Education (賽萊拉）: http://

4、www.celera.com/genomics/geneed/c/c/geneed/geneed.cfmBiology Animation Library （冷泉港）: http://vector.cshl.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htmhttp:/vector.cshl.org/dnaftb/Jeffrey Qinxi Shen’s Page （沈慶喜教授）: http://w

5、ww.unlv.edu/faculty/geffshen/Beginner’s Guide to Molecular Biology: http://www.iacr.bbsrc.ac.uk/notebook/courses/guide/Ergito (Genes VII 電子版）: http://www.genes.netTutorials in Molecular Biology: http://www.locutus.lsi

6、c.ucla.edu/ls3/tutorials/Graphics Gallery from gene to function: http://www.accessexcellence.org/AB/GC,分子生物學實驗參考書目,1 . 分子克隆實驗指南2. 精編分子生物學實驗指南3. PCR技術實驗指南4. 分子生物學實驗基礎5. 現(xiàn)代分生物學實驗技術7. 分子生物學實驗技術8. 分子生物學基礎技術,第一章

7、 緒 論,一、分子生物學的基本含義二、分子生物學的主要研究內(nèi)容三、分子生物學發(fā)展簡史四、分子生物學與其他學科的關系,,,3、主要任務 闡明生物大分子的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關系,2、研究對象 核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳 信息和細胞信息傳遞中的作用,1、定義 從分子水平研究生命本質(zhì)的一門新興邊緣學科,一、分子生物學的基本含義,,二、分子生物學的主要研究內(nèi)容,核酸的分子生物學 分離克隆

8、基因 （clone） 確定基因的結(jié)構(gòu) (structure) 基因的功能研究 (function) 生化功能 生理功能 基因表達調(diào)控研究 (express control)蛋白質(zhì)的分子生物學細胞信號轉(zhuǎn)導的分子生物學,三、分子生物學發(fā)展簡史,1.準備和醞釀階段(1865-1953) 蛋白質(zhì) DNA 2.初步建立和發(fā)展階段(1953

9、-1970) 中心法則 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能3.深入發(fā)展階段(1970-今） 重組DNA技術 基因組研究 基因表達調(diào)控 細胞信號轉(zhuǎn)導,1.準備和醞釀階段,(1822 - 1884),分離定律自由組合定律遺傳因子學說,,,,,孟德爾分離律圖示,,布爾諾（Brno）自然科學學會,德弗里斯 荷蘭,柯靈斯 德國,契馬克澳大利亞,“重新發(fā)現(xiàn)”孟德爾遺傳定律,Friedrich Miesc

10、her (1844-1895),1869年法國的米歇爾從白細胞核中分離出DNA1879年德國生物學家弗萊明發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)的染色體1903年美國細胞學家薩頓提出了遺傳的染色體學說 1909年丹麥生物學家約翰遜創(chuàng)造了基因（gene）一詞,Wilhelm Ludwig Johannsen 1857～1927,Thomas Hunt Morgan 1866～1945191

11、0年創(chuàng)立遺傳的染色體理論,2,1913年A.H.Stutervant提出以交換值作為染色體上基因相對距離的想法,1927年 美國遺傳學家繆勒發(fā)現(xiàn)X射線照射可人工誘使遺傳基因發(fā)生突變,1931Barbara McClintock和 Harriet Creighton : 轉(zhuǎn)座子假說,1902-1992,1941George Beadle 和E. L. Tatum：一基因一酶學說,DNA是遺傳物質(zhì)1928年 Frederick G

12、riffith,1944年Avery, MacLeod, and McCarty,噬菌體轉(zhuǎn)染實驗,1952年 Alfred Hershey and Martha Chase,2、建立和發(fā)展階段,1953 James Watson and Francis Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立,,1958Matthew Meselson and Franklin Stahl（DNA半保留復制 ）1961

13、Sidney Brenner, François Jacob & Matthew Meselson1966Marshall Nirenberg & Har Gobind Khorana（遺傳密碼破譯）1970 Hamilton Smith（DNA 限制酶 ）1972Paul Berg （DNA連接）,The central dogma,1970年， Baltimore和 Temin等同時

14、各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶,定向基因改造設想,設想一,能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？,能否讓細菌“吐出”蠶絲？,設想二,能否讓牛產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？,設想三,經(jīng)過多年的努力，科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術——基因工程。,3、深入發(fā)展階段,（二）技術上的四大發(fā)明,基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶,基因的針線——DNA連接酶,基因的車子——載體,逆轉(zhuǎn)錄酶,限制性內(nèi)切酶,能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核

15、酸水解酶大都從原核生物中發(fā)現(xiàn)提取的以內(nèi)切方式水解核酸鏈中磷酸二酯鍵 5’-P 3’-OH分類： Ⅰ型:復合功能酶,兼有修飾、切割兩種特性，識別位點 和切割位點不一致，不能形成特異片段。 Ⅲ型：與Ⅰ型相似。 Ⅱ型：通常所說的限制性內(nèi)切酶，識別序列為4～6個bp。,DNA連接酶,將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵

16、,載體,是攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。質(zhì)粒（plasmid)為最常用的載體。 可自主復制 有遺傳標記和篩選標記 具多克隆位點,X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷),IPTG （異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）,β-半乳糖苷酶（309個氨基酸）前146個氨基酸構(gòu)成一個短的片段稱為α片段，其余的稱為β片段,逆轉(zhuǎn)錄酶,1970年， Baltimor

17、e和 Temin等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學的中心法則，使真核基因的制備成為可能,1973年Cohen完成第一個基因工程實驗,經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,,所需元件： 限制性內(nèi)切酶 連接酶 載體 受體細胞,,1977年 Walter Gilbert and Frederick Sanger（DNA測序技術）,基因工程過程示意圖,①從細胞中分離出DN

18、A,,,②限制酶截取DNA片斷,③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒,④ DNA重組,⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因,Two Methods for Delivering DNA into Plant Cells,,,,1994Transgenic tomatoes sold in the shops,制備抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。,分離毒素蛋白基因,將毒素基因插入到Ti質(zhì)粒中,Two methods of producing t

19、ransgenic mice,轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程。,轉(zhuǎn)基因動物的一般制備過程（續(xù)）。,帶有人生長激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,正常小鼠,1988Transgenic sheep,α－抗胰蛋白酶,1989a transgenic pig,人生長激素基因,,,Producing Enviropigs,Transgenic pig,Microinjection of genes into pig egg,,克隆技術,,豬、牛

20、、馬、騾、猴、貓、水牛、大鼠、小鼠,體細胞克隆技術的應用——轉(zhuǎn)基因動物的制作,轉(zhuǎn)基因食品 安全性問題及對策,,,,1942年－1945年,1961年－1969年,1990年－2003年,1969年7月16日發(fā)射成功載人登月的阿波羅11號飛船,1945年8月6日上午8時15分17秒美國向廣島投放了稱為小男孩的原子彈,2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學家宣布人類基因組序列圖繪制成功，人

21、類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。,25000,基因組,一個生物的所有基因一套完整單體的遺傳物質(zhì)總和人類基因組計劃 Human　Genome　Project,HGP 于1990年正式啟動 識別人類DNA中所有基因 測定人類DNA的30億堿基對的序列 將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中 開發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具 解決可能引發(fā)的倫理,法律和社會問題,物種 DNA數(shù)量

22、HBV 3.2kb噬菌體 49kb大腸桿 4000kb酵母 17000kb果蠅 164000kb人 3000000kb,對人類而言：22+X+Y+mtDNA,人類基因組,100-200 kb克隆片段,基因組測序的一般流程,分級鳥槍測序法,基因組DNA,細菌人工染色體文庫,DNA克隆的排序 （物理作圖）,分段測序,隨機打斷后克隆,

23、DNA測序,DNA序列的組裝,2001年為止已經(jīng)測定了 599種病毒與類病毒 205種自然存在的質(zhì)粒 185種細胞器 31種真細菌 7種古細菌 1種真菌 2種動物 1種植物 2001年10月中國雜交水稻（秈稻）基因組工作框架圖完成2003年4月 人類基因組序列圖繪制成功2003年11月家蠶基因組“框架圖”繪制完成20

24、04年3月完成紅原雞基因組序列圖的測序和組裝工作2004年10月21日Mimivirus病毒的基因組圖譜繪制2005年 1月木瓜全基因組測序啟動。,截至到2005年有關分子生物學諾貝爾獲獎名單,年份 獲獎者 內(nèi)容 所獲的諾貝爾獎1962年 J.D.Wasten， DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 諾貝爾生理和醫(yī)學獎

25、 H.C.Click1965年 F.Jacob 基因調(diào)控乳糖操縱子 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 J.L.Monod1966年 F.P.Rous 病毒致癌學說 諾貝爾生理和醫(yī)學獎1968年 R.W.Holley 核糖核酸中心法則 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 H.

26、G.Khorana M.W.Nurenberg1969年 M.Delbruck 噬菌體基因研究 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 A.D.Hershey S.E.Luria1972年 S.Moore 核糖核酸三維結(jié)構(gòu) 諾貝爾化學獎 W.H.Stein1974年 A.Claude

27、 分離細胞發(fā)現(xiàn)RNA病毒 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 G.E.Palade,1975年 D.Baltimore 逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA病毒 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 H.M.Temin R.Dolbeco1978年 W.Arber DNA限制性內(nèi)切酶 諾貝爾生理和醫(yī)學獎

28、 D.Nathens H.O.Smith1980年 P.Berg 重組 DNA 諾貝爾化學獎 W.Gilbert DNA順序分析1982年 A.Klug 核酸蛋白復合體 諾貝爾化學獎1986年 R.L.Montalcini 生長因子 諾貝爾

29、生理和醫(yī)學獎 S.Cohen1988年 G.Eline 抗DNA合成類藥物 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 G.Hitchigns1989年 J.M.Bishop 癌基因?qū)W說 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 H.E.armans T.CachRNA 酶催化活性

30、 諾貝爾化學獎 S.Altman(Ribozyme),1993年 R.Roberts， 斷裂基因 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 P.sharp K.B.Mullis PCR儀 諾貝爾化學獎 M.Smith 寡聚核苷酸介導基因突變法 諾貝爾

31、化學獎1994年 A.Gliman 信號傳導和G-蛋白 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 M.Rodbell1995年 E.B.Lewis, C基因和果蠅突變關系探討 諾貝爾生理和醫(yī)學獎 Nusslein-Volhard， E.Wieschaus,（三）分子生物學的發(fā)展趨勢,進一步完善相關技術 微量化 自動化 產(chǎn)業(yè)

32、化 高通量學科的交叉、融合,2、細胞生物學與分子生物學關系 細胞是生命的基本功能單位，基因功能必須通過細胞來表現(xiàn)，離開細胞，就沒有生命。人工生命：美國洛克菲勒J. Craig Venter研究所,四、分子生物學與其他學科的關系,1、生物化學與分子生物學關系,分子生物學：信息傳遞過程生 物 化 學：物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過程生物化學是分子生物學的基礎；分子生物學≠生物化學,4、遺傳學與分子生物學關系 研