高效液相色譜的進樣器和色譜

1、高效液相色譜的進樣器和色譜進樣器進樣器早期使用隔膜和停流進們器，裝在色譜色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLCfj樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。1.隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方

2、便。但不能在高壓下使用(如10MPA以上)此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進樣重復(fù)性只能達到1～2%加之能碉各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析分析使用受到限制。2.停流進樣。可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”另一缺點是保留時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3.閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見

3、)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊子(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積在存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5～10%左右)，但耐高壓(35～40MPA)，進樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好(0.5%)，操作方便。(jy“9d3|s3J(OZ六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%(最多75%)，并要求每次進樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)

4、生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5～10倍9最少3倍)，這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)和流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。六通閥使用和維護注意事項：①樣品溶液進樣前必須用0.45UM濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣呂殘留在進樣閥中，每次分

5、析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。G6~Q5|B[4Es3Q4.自動進樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。:s3f$~s%S7L!m三、色譜柱三、色譜柱8F%gA%]6z色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂

6、)、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10UM等，柱效理論值可達5～16萬米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效對于同系物分析，只要500即可對于較難的分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10～30CM左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。7^2O0`C%U“hd3t$_柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，不要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱

7、中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠遠大于管壁效應(yīng)。1.柱的構(gòu)造柱的構(gòu)造反之亦然.③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去柱關(guān)的雜質(zhì).否則反沖會迅速降低柱效.④選擇使用適宜的流動相(尤其是PH)，以避免固定相被破

8、壞.有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和“，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解.⑤避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物生物樣品直接注入柱骨需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱.保護柱一般是填有固定相的短柱.保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換.⑥經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)，在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)