化學(xué)發(fā)光原理

1、簡介上世紀(jì)70年代中期Arakawe首先報道CLIA，發(fā)展至今已經(jīng)成為一種成熟的、先進的超微量活性物質(zhì)檢測技術(shù)，應(yīng)用范圍廣泛，近10年發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標(biāo)記免疫測定技術(shù)，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數(shù)量級，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯(lián)免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（618個月）、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優(yōu)點。高

2、靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)以被廣大研究人員所認(rèn)可，并正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光與放射免疫法是公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物和各種激素最精確和最成熟的檢測方法，二者的原理、技術(shù)與方法早已成熟并被國外各大醫(yī)院用于腫瘤檢測和激素檢測，二者的試劑與儀器均通過美國FDA認(rèn)證與我國藥監(jiān)局的批準(zhǔn)。但是，放射免疫分析法雖有很高的靈敏度，卻存在放射性防護和同位素污染的問題，況且試劑價格昂貴只有一個有保質(zhì)期，在基層醫(yī)療機構(gòu)難以普及?；瘜W(xué)放光免疫分析儀繼承了放射

3、免疫的所有優(yōu)點，同時克服了放射免疫和酶聯(lián)免疫各自的缺點，是臨床免疫檢測最理想的新方法?？梢钥隙ǖ恼f，她將取代放射免疫和酶聯(lián)免疫成為臨床免疫檢測最理想的新技術(shù)。[1]2原理化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個部分即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化形成一個激發(fā)態(tài)的中間體當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時同時發(fā)射出光子(hM)利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)

4、劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析)上或酶作用于發(fā)光底物。3類型化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種:(1)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法(2)酶標(biāo)記、以化學(xué)發(fā)光底物作信號試劑的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridiniumeste

5、r(AE)是有效的發(fā)光標(biāo)記物[3]其通過起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用而酮以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。ALP標(biāo)記的CLEIA所用底物為環(huán)122二氧乙烷衍生物這是一類很有前途的發(fā)光底物用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團——金剛烷基其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常使用的底物是AMPPD[32(2’2spiroadaman2tane)42me

6、thoxy242(3’2phosphoryloxy)2phenyl2122dioxetane]中文名為:32(2’2螺金剛烷)242甲氧基242(3’2磷酰氧基)2苯基2122環(huán)二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(ALP)作用下磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個磷酸基得到一個中等穩(wěn)定的中間體AMPD(半壽期為2～30min)此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子當(dāng)其回到基態(tài)時產(chǎn)生470nm的光可持續(xù)幾十分鐘

7、(如圖5)。AMPPD為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物可用來檢測堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結(jié)合物?？蓹z測到堿性磷酸酯酶的濃度為1015molL。美國DPC公司的Immulite全自動酶放大發(fā)光免疫分析儀以堿性磷酸酶為標(biāo)記物以金剛烷作發(fā)光底物測定靈敏度相當(dāng)于1021molmL的酶采用聚苯乙烯珠作載體其檢測水平已能達到1012gmL?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀是通過檢測患者血清從而對人體進行免疫分析的醫(yī)學(xué)檢驗儀器。將定量的患者血清和辣

8、根過氧化物（HRP）加入到固相包被有抗體的白色不透明微孔板中，血清中的待測分子與辣根過氧化物酶的結(jié)合物和固相載體上的抗體特異性結(jié)合。分離洗滌未反應(yīng)的游離成分。然后，加入魯米諾Luminol發(fā)光底液，利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體，從基態(tài)回到激發(fā)態(tài)，能量以光子的形式釋放。此時，將微孔板置入分析儀內(nèi)，通過儀器內(nèi)部的三維傳動系統(tǒng)，依次由光子計數(shù)器讀出各孔的光子數(shù)。樣品中的待測分子濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立的數(shù)學(xué)模型進行定量分析。最后，打印數(shù)據(jù)報告

9、，以輔助臨床診斷。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)概要一前言化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)是指某些化學(xué)反應(yīng)中發(fā)出可見光現(xiàn)象。最早發(fā)現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)生在生物體內(nèi)，發(fā)光生物體廣泛存在于自然界，大約有13大類近千種。1902年Schmitz最早合成的魯米諾發(fā)光試劑被廣泛用于血跡鑒定工作。國外化學(xué)發(fā)光分析方面的研究在20世紀(jì)六七十年代得到迅速發(fā)展，直到現(xiàn)在，化學(xué)發(fā)光分析的研究和應(yīng)用仍然是痕量分析領(lǐng)域的一個十分重要的研究方向。我國的化學(xué)發(fā)光

10、研究工作起步比較晚，到20世紀(jì)70年代后期才有介紹文章，80年代才有原始性的研究報道。在過去的20多年中，我國的化學(xué)發(fā)光從無到有，從小到大，從國內(nèi)走向國際，2004年9月第十一屆發(fā)光光譜分析國際會議在北京召開，標(biāo)志著我國的化學(xué)發(fā)光研究走上了一個新的臺階。隨著光電轉(zhuǎn)換技術(shù)的提高和計算機的普及和使用，化學(xué)發(fā)光儀器性能獲得空前的提高，化學(xué)發(fā)光的研究和應(yīng)用得到快速的發(fā)展，特別是在臨床檢驗和環(huán)境檢測方面已經(jīng)成為不可缺少的分析方法。化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)