二代測(cè)序(ngs)實(shí)驗(yàn)方案和應(yīng)用

1、這里為您介紹二代測(cè)序的相關(guān)流程和應(yīng)用。隨著人類基因組工程的完成，對(duì)于低花費(fèi)的測(cè)序技術(shù)的需求促進(jìn)了高通量二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。這些新的測(cè)序平臺(tái)允許進(jìn)行高通量測(cè)序，具有廣泛的應(yīng)用：?全基因組從頭測(cè)序或者重測(cè)序?目標(biāo)序列重測(cè)序?轉(zhuǎn)錄組分析?微生物組研究?基因調(diào)控研究NGS序列二代測(cè)序儀器有很多種組合，在通量、片段長(zhǎng)度、準(zhǔn)確度、每一輪測(cè)序成本、每百萬(wàn)堿基對(duì)測(cè)序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在存在差異。從規(guī)格和初始成本的角度而言，二代測(cè)序儀器可輕

2、松地分類為更窄的范圍，也就是所謂的“臺(tái)式測(cè)序儀”和高通量?jī)x器。臺(tái)式測(cè)序儀使得任何實(shí)驗(yàn)室都可以像使用realtimePCR一樣，自己進(jìn)行測(cè)序。這些儀器可以和一些靶標(biāo)序列富集技術(shù)相結(jié)合，用在一些臨床的應(yīng)用中，其中：選定的靶標(biāo)基因用于深度分析，以檢測(cè)稀有的突變，或者檢測(cè)多樣樣本中（比如癌癥樣本）中的突變。目前，這些儀器的通量在10Mb到7.5Gb之間，但是隨著硬件，軟件和試劑的持續(xù)改善，通量也在穩(wěn)步增加。高通量測(cè)序儀非常適合于大量的，基因組范

3、圍的研究，每次測(cè)序能測(cè)定600Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺(tái)，能測(cè)定的片段長(zhǎng)度相對(duì)較短，這對(duì)于高重復(fù)性的序列和未知基因組的從頭測(cè)序就可能成為問(wèn)題。與此相反，也有一些儀器能測(cè)序的片段較長(zhǎng)（達(dá)到2500bp），但是其精度和測(cè)序能力（90Mb）要低很多。還有一些測(cè)序能力位于兩者之間的儀器（~800bp，700Mb）。因此，應(yīng)用決定了哪一種儀器是最合適的。有一種新的方法被稱作“納米孔測(cè)序”。這種技術(shù)中，根據(jù)一個(gè)DNA鏈通過(guò)一個(gè)合成的

4、或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變，可以確定通過(guò)這個(gè)孔道的堿基。這理論上可以僅用一步就測(cè)序一個(gè)完整的染色體，而不需要生成新的DNA鏈。DNA測(cè)序二代DNA測(cè)序的工作流程如下：?DNA樣本制備?文庫(kù)構(gòu)建和驗(yàn)證?文庫(kù)分子大規(guī)模平行克隆擴(kuò)增?測(cè)序二代測(cè)序DNA樣本的質(zhì)量控制首先，評(píng)價(jià)基因組DNA的質(zhì)量是非常必要的（完整性和純度）。凝膠電泳法對(duì)于大多數(shù)商業(yè)化的二代測(cè)序平臺(tái)，使用諸如橋式擴(kuò)增或者乳液PCR方法，對(duì)文庫(kù)中的DNA片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，以

5、產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測(cè)序模板非常必要。通過(guò)將平臺(tái)特異性的適配子與感興趣的DNA源（比如基因組DNA、雙鏈cDNA或者PCR擴(kuò)增子等所產(chǎn)生的DNA片段）退火，得到片段文庫(kù)。適配子序列的存在，使得我們可以對(duì)文庫(kù)分子進(jìn)行選擇性的克隆擴(kuò)增。因此，這種方法不需要像傳統(tǒng)的方法那樣，在微生物中間體中，對(duì)基因組片段進(jìn)行微生物克隆。另外，適配子序列中，還含有平臺(tái)特異性的測(cè)序引物的結(jié)合位點(diǎn)。通常情況下，一個(gè)常規(guī)的DNA文庫(kù)構(gòu)建方案包含四步：?片段化DNA?對(duì)

6、DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)?連接適配子序列（不適用于單分子測(cè)序）?對(duì)可選的文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組DNA碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動(dòng)力剪切法。這四種方法都可以用于文庫(kù)構(gòu)建，但是每一種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。核酸內(nèi)切酶消化的方法快速并且容易，但是難以精確的控制片段長(zhǎng)度的分布。另外這種方法可能會(huì)對(duì)基因組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA的雙鏈打斷，這種斷裂是隨機(jī)的，因此能在文庫(kù)中對(duì)DNA進(jìn)行無(wú)偏的

7、呈遞。可以使用瓊脂糖凝膠電泳或者自動(dòng)化的DNA分析方法，對(duì)DNA片段的尺寸分布進(jìn)行控制。片段化DNA之后，需要將DNA修復(fù)，產(chǎn)生5’磷酸化的平末端DNA，以便能夠和測(cè)序平臺(tái)特異性的適配子相連接。文庫(kù)構(gòu)建的效率直接依賴于DNA末端修復(fù)的效率和準(zhǔn)確性。末端修復(fù)混合溶液將5’或者3’的粘性末端轉(zhuǎn)變成5’磷酸化的平末端DNA。在大多數(shù)情況下，末端修復(fù)通過(guò)T4DNA聚合酶的5’—3’聚合酶活性和3’—5’的核酸外切酶活性完成。而T4多聚核苷酸激酶

8、確保平末端的DNA片段5’端的磷酸化，以便進(jìn)行后續(xù)的適配子連接。根據(jù)所使用的測(cè)序平臺(tái)，平末端DNA片段可以直接與適配子連接，或者需要在其片段的3’端增加一個(gè)單獨(dú)的突出的腺苷酸A，以便與平臺(tái)特異性適配子上突出的胸苷酸T相互配對(duì)。通常情況下，使用Klenow片段（具有最低的3’到5’端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步驟。T4DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫(kù)片段修復(fù)過(guò)的末端相連，然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DN

9、A的尺寸，選擇性去除文庫(kù)中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過(guò)程中可能出現(xiàn)適配子的二聚體，它們會(huì)和與適配子連接的文庫(kù)片段共同擴(kuò)增，從而降低測(cè)序平臺(tái)對(duì)真正文庫(kù)片段測(cè)序的能力并且降低測(cè)序的質(zhì)量，因此在測(cè)序之前，必須將它們從文庫(kù)中除去。一些測(cè)序平臺(tái)要求文庫(kù)片段的長(zhǎng)度分布在比較窄的范圍內(nèi)，以得到最佳的結(jié)果，很多時(shí)候，這只能通過(guò)去除凝膠電泳上的相應(yīng)的片段條帶實(shí)現(xiàn)。這

10、種方法也可以用來(lái)去除適配子二聚體。完成這一步驟之后，應(yīng)該對(duì)DNA片段文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)濃度和測(cè)序文庫(kù)的適配子設(shè)計(jì)，既可以直接稀釋溶液并用于測(cè)序，也可以對(duì)文庫(kù)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。在文庫(kù)擴(kuò)增階段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的適配子序列，通過(guò)與PCR引物的重疊，用于后續(xù)的克隆擴(kuò)增和與測(cè)序引物結(jié)合，或者提高DNA文庫(kù)的產(chǎn)量。為了得到最佳的文庫(kù)擴(kuò)增結(jié)果，要求DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估方法，參見(jiàn)