【生物化學】第十二章 翻譯

1、蛋白質的生物合成（翻譯）Protein Biosynthesis，Translation,第 十 二 章,蛋白質的生物合成，即翻譯，就是將mRNA中由 4 種核苷酸序列編碼的遺傳信息，通過遺傳密碼破譯的方式解讀為蛋白質一級結構中20種氨基酸的排列順序 。,翻譯動畫,蛋白質合成的基本條件,第 一 節(jié),原料：20種氨基酸rRNA:和蛋白質組成核糖體（翻譯場所）tRNA:攜帶并轉運AAmRNA：翻譯的直接模板酶：氨基酰－tRNA合

2、成酶 轉肽酶（肽酰轉移酶）蛋白質因子：IF、EF、RF能量：游離三磷酸核苷酸（ATP、GTP）無機離子：Mg2+,參與蛋白質生物合成的物質,蛋白質的生產,mRNA,AA,rRNA蛋白質,tRNA,AA-tRNA合成酶,轉肽酶,一、翻譯模板mRNA及遺傳密碼,mRNA是遺傳信息的攜帶者和傳遞者是蛋白質生物合成的直接模板,mRNA種類多，大小不一，半衰期短占RNA總量1％－2％,原核生物的多順反子

3、一條mRNA編碼幾種功能相關的蛋白質,真核生物的單順反子 一條mRNA僅編碼一種蛋白質,,,,,,目 錄,單復制子，多順反子,多復制子，單順反子,密碼子,mRNA上，從5?至3?方向，由AUG開始，每3個核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個氨基酸或蛋白質合成的起始、終止信號，稱為三聯(lián)體密碼(triplet coden)。,起始密碼(initiation coden): AUG （Met）,終止密碼(termination coden)

4、:（無意義密碼子）不編碼任何AA UAA，UAG，UGA,密碼子總64個，其中編碼AA 的為61個,從mRNA 5?端起始密碼子AUG到3?端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質多肽鏈，稱為開放閱讀框架(open reading frame, ORF)。,開放閱讀框架,原核生物的多順反子 一條mRNA編碼幾種功能相關的蛋白

5、質,真核生物的單順反子 一條mRNA僅編碼一種蛋白質,,,,,,目 錄,單復制子，多順反子,多復制子，單順反子,,,,,ORF,遺傳密碼表,遺傳密碼的特點：方向性（directionality）連續(xù)性（commalessness）簡并性（degeneracy）通用性（universality）擺動性（wobble）,1. 方向性(directionality),5?端：起始密碼子3?端：終止密碼子密碼子方向：

6、 5? →3?翻譯過程模板閱讀方向：5? →3?翻譯過程多肽鏈延長方向：N端→C端,2. 連續(xù)性(commaless),編碼蛋白質氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。 （3N＋1）或者（3N＋2）個堿基的插入或者缺失可以導致移碼突變。,遺傳密碼的連續(xù)性,3. 簡并性(degeneracy),遺傳密碼中，除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個密碼子外，其余氨基酸有2、3、4個或多至6個三聯(lián)體為其編碼。這種多個密碼子編碼

7、一個AA的現(xiàn)象。編碼 同一AA的密碼子稱同義密碼子。,一個密碼子僅編碼一種AA，每個密碼子的使用頻率，有種族和組織差異,同義突變、錯義突變、無義突變,簡并性(degeneracy),遺傳密碼表,,,,,目 錄,4. 擺動性(wobble),反密碼與密碼間不嚴格遵守堿基互補配對規(guī)律，稱為擺動配對。,U,擺動配對,反密碼第一位與密碼第三位不嚴格配對,U,密碼子、反密碼子配對的擺動現(xiàn)象,5. 通用性(universality，普遍性),

8、蛋白質生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。 已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動物細胞的線粒體、植物細胞的葉綠體，如: 線粒體 通用密碼 起始密碼： AUG、AUA(Met)、AUU AUG(Met) 終止密碼： AGA、AGG UAA、UAG、UGA UGA(Trp) AGA和AGG(Arg)

9、 密碼的通用性進一步證明各種生物進化自同一祖先。,二、rRNA參與組成核蛋白體,核蛋白體的組成,,小亞基：mRNA結合位點 1、P位點：結合肽酰－tRNA，或給位 2、A位點：結合氨基酰－tRNA，或受位 3、轉肽酶(肽酰轉移酶)活性部位 4、E位：排出卸載tRNA，排出位,,大亞基,原核生物翻譯過程中核蛋白體結構模式:,A

10、位：氨基酰位(aminoacyl site),P位：肽酰位(peptidyl site),E位：排出位(exit site),轉肽酶(肽酰轉移酶),,三、tRNA與氨基酸的活化,反密碼環(huán),氨基酸臂,,,氨基酸臂,額外環(huán),5′,3′,C A U,5’,3’,,tRNA是蛋白質生物合成過程中氨基酸的轉運工具 密碼子與反密碼子的擺動現(xiàn)象 原核30-40種tRNA,真核50種tRNA 編碼AA的密碼子61種 tRNA分

11、子3′末端的CCA序列是氨基酸結合部位。每一種特異的tRNA只能轉載特異的氨基酸。,（一）tRNA,tRNA的三級結構示意圖,DHU環(huán)是AA-tRNA合成酶識別部位TψC環(huán)結合核糖體,（二） 氨基酰-tRNA合成酶,氨基酰-tRNA合成酶(aminocyl-tRNA synthetase)催化tRNA的3′-末端CCA-OH與氨基酸羧基形成酯鍵，生成：氨基酰-tRNA。,氨基酰-tRNA合成酶對底物AA和tRNA都有高度特異性。氨基

12、酰-tRNA合成酶具有校正活性。,氨基酸 + ATP-E → 氨基酰-AMP-E + PPi2. 氨基酰-AMP-E + tRNA → 氨基酰-tRNA + E +AMP,第一步反應,氨基酸 ＋ATP-E —→ 氨基酰-AMP-E ＋ PPi,第二步反應,氨基酰-AMP-E ＋ tRNA ↓ 氨基酰-tRNA ＋ AMP ＋ E,細胞內的tRNA的種類多于20種，故一種氨基酸可由幾種tRNA裝載但一種tRNA只能

13、裝載一種氨基酸,氨基酰-tRNA的表示方法： Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNAMet 起始肽鏈合成的氨基酰-tRNA,真核生物： Met-tRNAiMet原核生物： fMet-tRNAifMet,蛋白質生物合成過程 The Process of Protein Biosynthesis,,第 二 節(jié),mRNA模板閱讀的方向：5′

14、→3′蛋白質是從N端→C端合成 原核生物的起始tRNA是結合甲酰蛋氨酸的tRNA——fMet-tRNAifMet 真核生物的起始tRNA是結合蛋氨酸的tRNA——Met-tRNAiMet,一、翻譯的起始階段,指mRNA、起始氨基酰-tRNA、起始因子與核蛋白體結合而形成翻譯起始復合物 (translational initiation complex)。,原核起始因子 功能IF-1

15、 占據(jù)A位，防止tRNA過早地結合到A位IF-2 促進fMet-tRNA結合到30S小亞基IF-3 促進大小亞基分離,結合30S小亞基，防止

16、 它過早地與50S大亞基結合，并提高P位對fMet-tRNAfMet的特異性,原核、真核生物各種起始因子的生物功能,（一）起始因子,真核起始因子 功能eIF-1 多功能因子，參與多個翻譯步驟eIF-2 促進起始Met-tRNA與核糖體40S小亞基結合eIF-

17、2B 又稱鳥苷酸交換因子，將eIF-2上的GDP交換 成GTPeIF-3 首先與40S小亞基結合的因子，促進大小亞基分離，并能加速后續(xù)步驟eIF-4A 具有RNA解旋酶的活性，能解除mRNA 5´端的發(fā)夾結構，使其與40S小亞基結合。是eIF4F的組成成分,真核起始因子 功能eIF-4B 與mRNA結合，對mRNA進行掃描并定位第一個AUGeIF-4E 結合mRNA的帽子結構，是e

18、IF4F的組成成分eIF-4G 一種接頭蛋白，能與eIF4E、eIF-3和poly A結合蛋白（Pab-1p）結合將40S的小亞基富集至mRNA，進而刺激翻譯。是eIF4F的組成成分eIF-5 促進上述起始因子從40S小亞基脫落，以便40S小亞基與60S大亞基結合形成80S起始復合物eIF-6 促進無活性的80S核糖體解聚生成40S小亞基和60S大亞基,（一）原核生物翻譯起始,核蛋白體大小亞基分離；mRNA在小亞基

19、定位結合；fMet-tRNAfMet的結合； 核蛋白體大亞基結合。,IF-3,IF-1,1. 核蛋白體大小亞基分離,,,,,目 錄,起始因子IF3使大小亞基分離，IF1協(xié)助70s核糖體→30s小亞基+50s大亞基,IF-3,IF-1,2. mRNA在小亞基定位結合,mRNA AUG上游S-D序列（AGGA）與小亞基16s rRNA上UCCU序列互補，緊接AGGA的小段又可以被核糖體小亞基蛋白（rps-1）辨認結合，即RNA-RNA

20、、RNA-蛋白質相互辨認。,S-D序列 mRNA上起始密碼子AUG上游富含嘌呤的4-6個核苷酸序列，其核心：AGGA。又稱核蛋白體結合位點（RBS）,IF-3,IF-1,3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAifmet )結合到小亞基,IF2（GTP）作用下，fMet-tRNA反密碼子與mRNA分子中密碼子AUG配對結合，形成30S起始復合物，需要GTP和Mg2+參與。,IF-3,IF-1,IF-2,,GTP,G

21、DP,Pi,4. 核蛋白體大亞基結合，起始復合物形成,,,,,目 錄,50S大亞基與上述的30S前起始復合物結合，同時IF2脫落，形成70S起始復合物，即核糖體大小亞基－mRNA－fMet-tRNA復合物。 fMet-tRNA占據(jù)著50S大亞基的P位。A位留空 。,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,,,,,目 錄,真核生物 原核生物起始因子： eIF，10多種 IF，三種起

22、始tRNA： Met-tRNA fMet-tRNA N端甲?；痬RNA結合： 有帽尾結構 SD序列核糖體： 80S（40S＋60S） 70S （30S＋50S）,（二）真核生物翻譯起始,原核生物與真核生物翻譯起始比較,核蛋白體大小亞基分離；Met-tRNAMet結合；mRNA在核蛋白體小亞基就位；核蛋白體大亞基結合。,真核生物翻譯起始復合物形成過程,1、核蛋白體大小亞基分離,eIF

23、-3,,2、Met-tRNAMet結合（43S前起始復合物生成）,eIF2，真核翻譯起始最重要的因子先生成 Met-tRNAMet－elF-2－GTP三元復合物再與40S小亞基結合,3、mRNA在核蛋白體小亞基就位（48S復合物的形成）,48S復合物的形成,eIF-4E與mRNA帽結合 eIF-4G作為接頭蛋白連接eIF-4E和eIF-3 Pab1p與mRNA的poly A尾巴結合，也與eIF-4G結合,eIF-4F（帽子結合

24、復合物）=4E+4G+4A,4、核蛋白體60S大亞基結合（80S起始復合物的形成）,80S核糖體－Met-tRNAmet－mRNA起始復合物,真核生物翻譯起始復合物形成過程,elF-2是關鍵因子,e IF2是生成起始復合物首先必需的蛋白質因子 ，是真核生物蛋白質合成調控的關鍵物質，也是作為眾多生物活性物質、抗代謝物、抗生素等物質作用的靶點。,二、肽鏈合成延長,指根據(jù)mRNA密碼序列的指導，次序添加氨基酸從N端向C端延伸肽鏈，直到合成終止

25、的過程。,肽鏈延長在核蛋白體上連續(xù)性循環(huán)式進行，又稱為核蛋白體循環(huán)(ribosomal cycle)，每次循環(huán)增加一個氨基酸，包括以下三步：進位(entrance)成肽(peptide bond formation)轉位(translocation),延長過程所需蛋白因子稱為延長因子(elongation factor, EF)原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)EF-G真核生物：eEF-1 、eEF-2,肽鏈合

26、成的延長因子,又稱注冊(registration),（一）進位,密碼子對應的氨基酰-tRNA進入A位，消耗一分子GTP（EF-Tu協(xié)助）,,,,,目 錄,EF-Tu-GTP催化進位（原核生物）,Tu,Ts,GTP,,GDP,,Tu,,Ts,－GTP,,,,,目 錄,（二）成肽,由轉肽酶(transpeptidase)催化P位上氨基酸α-COOH基與A位氨基酸的α-NH2形成肽鍵。,（三）轉位,延長因子EF-G有轉位酶( transloc

27、ase )活性，可結合并水解1分子GTP，促進核蛋白體向mRNA的3'側移動。,fMet,fMet,,,,,目 錄,核蛋白體循環(huán)（狹義）,肽鏈延長,真核生物肽鏈合成的延長過程與原核基本相似，但有不同的反應體系和延長因子。另外，真核細胞核蛋白體沒有E位，轉位時卸載的tRNA直接從P位脫落。,（四）真核生物延長過程,延長時的能量消耗：,每添加一個氨基酸消耗4個高能磷酸鍵活化：2個ATP進位：1個GTP移位：1個GTP,三、肽

28、鏈合成的終止,當mRNA上終止密碼出現(xiàn)后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，mRNA、核蛋白體等分離，這些過程稱為肽鏈合成終止。,終止相關的蛋白因子稱為釋放因子 (release factor, RF),一是識別終止密碼，如RF-1特異識別UAA、UAG；而RF-2可識別UAA、UGA。二是誘導轉肽酶改變?yōu)轷ッ富钚裕喈斢诖呋孽；D移到水分子-OH上，使肽鏈從核蛋白體上釋放。,釋放因子的功能,原核生物釋放因子：RF-1，

29、RF-2，RF-3 真核生物釋放因子：eRF,原核肽鏈合成終止過程,RF,,,,,,目 錄,多肽鏈合成終止演示,多聚核蛋白體,——使蛋白質合成高效高速進行。原因：mRNA壽命較短,在一條mRNA鏈上結合著多個核糖體成串珠樣排列，同時合成多條相同的多肽鏈 。,電鏡下的多聚核蛋白體現(xiàn)象,,,,,目 錄,多聚核蛋白體,蛋白質合成后加工和輸送Posttranslational Processing & Protein Trans

30、portation,第 三 節(jié),從核蛋白體釋放出的新生多肽鏈不具備蛋白質生物活性，必需經過不同的翻譯后復雜加工過程才轉變?yōu)樘烊粯嬒蟮墓δ艿鞍住?主要包括,多肽鏈折疊為天然的三維結構 肽鏈一級結構的修飾高級結構修飾,一、多肽鏈折疊為天然功能構象的蛋白質,新生肽鏈的折疊在肽鏈合成中、合成后完成，新生肽鏈N端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折疊即開始?？赡茈S著序列的不斷延伸肽鏈逐步折疊，產生正確的二級結構、模序、結構域到形成完整空間構象。

31、一般認為，多肽鏈自身氨基酸順序儲存著蛋白質折疊的信息，即一級結構是空間構象的基礎。細胞中大多數(shù)天然蛋白質折疊都不是自動完成，而需要其他酶、蛋白輔助。,幾種有促進蛋白折疊功能的大分子,1. 分子伴侶 (molecular chaperon) 2. 蛋白二硫鍵異構酶 (protein disulfide isomerase, PDI)3. 肽-脯氨酰順反異構酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase,

32、PPI),1. 熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 2. 伴侶素(chaperonins) GroEL和GroES家族,分子伴侶,分子伴侶是細胞一類保守蛋白質，可識別肽鏈的非天然構象，促進各功能域和整體蛋白質的正確折疊。,熱休克蛋白促進蛋白質折疊的基本作用——結合保護待折疊多肽片段，再釋放該片段進行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結合、解離的循環(huán)。,伴侶素G

33、roEL/GroES系統(tǒng)促進蛋白質折疊過程,伴侶素的主要作用——為非自發(fā)性折疊蛋白質提供能折疊形成天然空間構象的微環(huán)境。,蛋白二硫鍵異構酶,多肽鏈內或肽鏈之間二硫鍵的正確形成對穩(wěn)定分泌蛋白、膜蛋白等的天然構象十分重要，這一過程主要在細胞內質網進行。,二硫鍵異構酶在內質網腔活性很高，可在較大區(qū)段肽鏈中催化錯配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白質形成熱力學最穩(wěn)定的天然構象。,肽-脯氨酰順反異構酶,多肽鏈中肽酰-脯氨酸間形成的肽鍵有

34、順反兩種異構體，空間構象明顯差別。,肽酰-脯氨酰順反異構酶可促進上述順反兩種異構體之間的轉換。,肽酰-脯氨酰順反異構酶是蛋白質三維構象形成的限速酶，在肽鏈合成需形成順式構型時，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準確折疊。,二、一級結構的修飾,（一）肽鏈N端的修飾（二）個別氨基酸的修飾（三）多肽鏈的水解修飾,去除N-甲?；騈-蛋氨酸（第一個氨基酸fMet-tRNAfmet）A、脫甲?；福喝コ齆-甲酰基B、氨基肽酶：N端水解，

35、去除氨基端蛋氨酸或一段肽（信號肽）,(一) 一級結構的修飾,(二)化學修飾A、羥化：羥脯氨酸，羥賴氨酸B、磷酸化：絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸的羥基磷酸化，蛋白激酶催化C、二硫鍵的形成：二個半胱氨酸的疏基氧化形成胱氨酸 鏈內二硫鍵，鏈間二硫鍵（胰島素）,鴉片促黑皮質素原(POMC)的水解修飾,（三）多肽鏈的水解修飾及內含肽的切除,三、高級結構的修飾,（一）亞基聚合 （二）輔基連接（三）疏水脂鏈的共價連接,,3.1 亞基聚合,具

36、有四級結構的蛋白質由兩條以上肽鏈通過非共價鍵聚合，形成寡聚體才有生物活性。,膜上的鑲嵌蛋白、跨膜蛋白常是寡聚體。 如：血紅蛋白分子的α2β2聚合。,,3.2 輔基連接,糖蛋白、脂蛋白，各種帶輔酶的酶等都是結合蛋白，合成后需和相應的輔基結合。,3.3 疏水脂鏈的共價連接,某些蛋白質，如，Ras蛋白、G蛋白等，通過脂鏈嵌入疏水膜脂雙層，定位成為特殊質膜內在蛋白質，才成為具有生物功能的蛋白質 。,蛋白質合成后去路1、保留在胞漿2、進入線粒

37、體、細胞核等細胞器3、分泌至體液，然后輸送到該蛋白質應起作用的靶器官和靶細胞,四、蛋白質合成后的靶向輸送,,穿膜,蛋白質合成后需要經過復雜機制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細胞靶部位，這一過程稱為蛋白質的靶向輸送。,?蛋白質的靶向輸送(protein targeting),蛋白質穿膜條件：信號肽 轉運的機構,真核細胞分泌蛋白等前體合成后靶向輸送過程首先要進入內質網。,主要為N末端特異氨基酸序列，可引導蛋

38、白質轉移到細胞的適當靶部位，這一序列稱為信號序列（信號肽） 。,? 信號序列(signal sequence),結構：12-35個氨基酸N端 帶正電氨基酸 中性氨基酸 小分子氨基酸（加工區(qū)）C端 賴、精 亮、異亮 甘、丙、絲堿性氨基酸末端 疏水區(qū) 被信號肽酶裂解,信號肽的一級結構,?蛋白質的靶向輸送,分泌蛋白進入內質網的過程,真核細胞分泌蛋白等前體合成后靶向輸送過程首先要進

39、入內質網。1、信號肽被SRP結合2、SRP把核糖體帶至內質網膜胞漿面3、信號肽帶蛋白質穿膜（SRP與SRP受體結合后）4、信號肽被信號肽酶水解（加工區(qū)）5、蛋白折疊成功能構象,,分泌性蛋白進入內質網的信號肽引導機制,,,1.SRP識別信號肽并結合,,2.SRP將核蛋白體帶到內質網膜,3.ER膜通道開放,胞液,（二）線粒體蛋白的靶向輸送,（三）細胞核蛋白的靶向輸送,蛋白質生物合成的干擾和抑制Interference &

40、; Inhibition of Protein Biosynthesis,第 四 節(jié),蛋白質生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶點。它們就是通過阻斷真核、原核生物蛋白質翻譯體系某組分功能，干擾和抑制蛋白質生物合成過程而起作用的。 可針對蛋白質生物合成必需的關鍵組分作為研究新抗菌藥物的作用靶點。同時盡量利用真核、原核生物蛋白質合成體系的任何差異，以設計、篩選僅對病原微生物特效而不損害人體的藥物。,抗生素(antibiotic

41、s)是微生物產生的能夠殺滅或抑制細菌的一類藥物。,抗代謝藥物指能干擾生物代謝過程，從而抑制細胞過度生長的藥物，如：6-MP。,某些毒素也作用于基因信息傳遞過程。,一、抗生素類,四環(huán)素（tetracyclin）族：與原核生物小亞基結合，抑制氨基酰-tRNA進位氯霉素（chloromycrtin）：與原核生物大亞基結合，抑制轉肽酶，阻斷翻譯延長過程 ，高濃度時對真核線粒體也有作用 鏈霉素（streptomycin）卡那霉

42、素（karamycin）： 與原核生物小亞基結合，引起讀碼錯誤，抑制起始,嘌呤霉素（puromycin）： 結構與酪氨酰-tRNA相似，取代氨基酰-tRNA進入A位，使肽鏈延長終止放線菌酮（cycloheximide）： 特異抑制真核生物核蛋白體轉肽酶紅霉素：與原核生物大亞基結合，抑制轉肽酶、妨礙轉位,抗生素抑制蛋白質生物合成的原理,嘌呤霉素作用示意圖,,四環(huán)素族,,氯霉素,,鏈霉素和卡那霉素,,放線菌酮（真核）,,,,,目 錄

43、,二、其他干擾蛋白質生物合成的物質,毒素(toxin)干擾素(interferon),白喉毒素(diphtheria toxin)的作用機理,,白喉毒素,+,+,NAD+,維生素PP,干擾素的作用機理,1. 干擾素誘導eIF2磷酸化而失活,2. 干擾素誘導病毒RNA降解,,復習思考題,1、名詞解釋：翻譯，密碼子，ORF，信號肽2、參與蛋白質生物合成的物質有哪些，各有何作用？3、遺傳密碼有哪些特點？4、按下列DNA單鏈：5’