土壤微生物的分離與鑒定

1、土壤微生物的分離與鑒定土壤微生物的分離與鑒定組員：鞏鵬鵬、高艷雙、顧斐、曹凌雪、白相林、楊金玉組員：鞏鵬鵬、高艷雙、顧斐、曹凌雪、白相林、楊金玉實(shí)驗(yàn)時(shí)間：實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2006年12月11號(hào)——2007年1月15號(hào)關(guān)鍵詞：土壤微生物，分離鑒定，生理生化，關(guān)鍵詞：土壤微生物，分離鑒定，生理生化，實(shí)驗(yàn)摘要：實(shí)驗(yàn)摘要：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多種類(lèi)群的微生物，它們對(duì)自然界物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和循環(huán)起著極為重要的作用，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)有著不可忽視

2、的影響。根際微生物與植物的關(guān)系特別密切，不同的土壤和植物對(duì)根際微生物產(chǎn)生顯著影響，而不同的根際微生物由于其生理活性和代謝產(chǎn)物的不同，也將對(duì)土壤肥力和植物營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)生積極或消極的作用。土壤微生物不僅對(duì)土壤的肥力和土壤營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化起著重要作用，而且對(duì)于進(jìn)入土壤中的農(nóng)藥及其他有機(jī)污染物的自凈、有毒金屬及其化合物在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化等都起著極為重要的作用。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類(lèi)型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說(shuō)，在土壤表面，由于日

3、光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm～30cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌數(shù)減少。土壤中微生物以細(xì)菌數(shù)量最多，為幾百萬(wàn)個(gè)克土至幾億個(gè)克土，有各種生理類(lèi)群，營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型多屬異養(yǎng)型，鑒別染色多為革蘭氏陽(yáng)性。放線菌含量為幾萬(wàn)個(gè)克土至幾百萬(wàn)個(gè)克土，但其生物量不比細(xì)菌低，因?yàn)榫z體積較大。土壤中真菌含量為幾千個(gè)克土至幾十萬(wàn)個(gè)克土，而其生物量常比細(xì)菌的大。酸性土壤中真菌較多。藻類(lèi)在土壤中的含量不及微生物總數(shù)的1％，生長(zhǎng)在潮濕土壤

4、的表層。原生動(dòng)物在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中較多。通過(guò)土壤微生物的分離與計(jì)數(shù)及劃線純化，涂布分離長(zhǎng)出的單菌落，須經(jīng)劃線純化，再轉(zhuǎn)斜面培養(yǎng)后保藏備用。涂布分離細(xì)菌的平板，溫箱培養(yǎng)2d～3d后，于室溫下放置3d或2d，使菌落性狀表現(xiàn)較充分，然后挑取各單菌落的部分培養(yǎng)物，在預(yù)先制備好的平板上劃線純化。達(dá)到分離純化認(rèn)識(shí)土壤中微生物的目的，并掌握各種相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：(一)對(duì)土壤中微生物的分離篩選及鑒定從混雜的微生物群體中獲得只含有某

5、一種或某一株微生物的過(guò)程成為微生物的分離與純化，常用的方法有簡(jiǎn)易的細(xì)胞挑取法和平板分離法。其中平板分離法操作簡(jiǎn)單，普遍用于微生物的分離與純化，奇跡般原理包括兩個(gè)方面：（1）遜則適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件如營(yíng)養(yǎng)，酸堿度，溫度或氧等要求或加入某種抑制劑造成只有利于該種微生物生長(zhǎng)，而抑制其它微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成單個(gè)的菌落可以是由一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成的集合體。因而可以通過(guò)挑取單個(gè)菌落

6、而獲得一種純培養(yǎng)，或去掉那個(gè)菌落的方法可由稀釋涂布和平板劃線等技術(shù)完成。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含有的微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類(lèi)都是極其豐富的。土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多有價(jià)值的微生物菌株。菌株的鑒定的生理生化實(shí)驗(yàn)糖發(fā)酵與氧化試驗(yàn)在細(xì)菌的分類(lèi)鑒定中，糖類(lèi)發(fā)酵與氧化測(cè)定是一項(xiàng)重要依據(jù)。特別是對(duì)細(xì)菌的鑒定尤為重要。常用的發(fā)酵與氧化的糖類(lèi)包括單糖，雙糖，多糖三類(lèi)：如葡萄糖，蔗糖，淀粉

7、一、分離與純化1.準(zhǔn)備將內(nèi)裝90ml的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培養(yǎng)基、涂布棒、試管（內(nèi)裝9ml蒸餾水）若干、平皿若干放入高壓鍋高溫滅菌。2.稀釋將土壤樣品10g加入90ml滅菌水中振蕩20分鐘，形成土壤懸濁液，取1ml加入裝有9ml滅菌水試管中振蕩形成102稀釋?zhuān)来螌⑼寥罉悠废♂?03、104、105、106、1073.涂布平板將105、106、107的稀釋樣品分別涂布到已制好的固體培養(yǎng)基平板上，每種涂3個(gè)平板。4.培養(yǎng)將

8、平板置于37。C恒溫培養(yǎng)三天。5.分離從平板中挑取單個(gè)菌落進(jìn)行平板劃線分離培養(yǎng)，培養(yǎng)2天，共選了4種菌。6.純化將劃線長(zhǎng)出的菌接種于已準(zhǔn)備好的固體斜面培養(yǎng)基中。培養(yǎng)2天。7.鏡檢對(duì)平板中的4種菌分別進(jìn)行美藍(lán)染色、革蘭氏染色、芽孢染色，放在顯微鏡下觀察，并記錄結(jié)果。8.保種將長(zhǎng)出菌的斜面放入冰箱中保存。二、生理生化實(shí)驗(yàn)（一）糖類(lèi)發(fā)酵與氧化實(shí)驗(yàn)一、器具或材料試管、接種針、恒溫箱等糖類(lèi)發(fā)酵與氧化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基（半固體）二、操作步驟1、接種：以移接

9、18—24小時(shí)待鑒定的菌用接種針穿刺接種。接4支，其中2支用滅菌的凡士林或石蠟洋菜上封蓋，以隔絕空氣為閉管，另2支不封為開(kāi)管，同時(shí)要有不接種的閉管作對(duì)照。2、培養(yǎng)：置于37度恒溫箱中，培養(yǎng)8—16個(gè)小時(shí)，1天、3天和7天3、觀察：在上述培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)觀察試管中指示劑的變化情況三、結(jié)果在8小時(shí)、16小時(shí)檢查，若培養(yǎng)基柱上部變黃，下部仍為綠色，則證明為氧化型，全部變黃或下部變黃上部為綠，則為發(fā)酵型。（二）過(guò)氧化酶測(cè)定一、器具與材料試管、培養(yǎng)皿、