蟾毒靈新型蛋白聚合物納米載體的制備及其體內(nèi)外評價.pdf

1、蟾毒靈是一種水溶性差的具有廣譜抗腫瘤活性的中藥單體，但是，其體內(nèi)半衰期短，且有心臟毒性。因此，為攻克這些難題，本課題以聚氰基丙烯酸烷酯類納米載體作為內(nèi)殼，模擬脂蛋白結(jié)構(gòu)特征，在納米粒外表面包載修飾有靶向配基的親水蛋白，構(gòu)建新型“觸發(fā)式”蛋白聚合物納米載體。本課題就蟾毒靈納米載體的制備、載藥性能、生物相容性、靶向性以及藥效學(xué)等為考察方向展開工作，全文分為五項內(nèi)容:
　　第一項綜述
　　綜述分兩個部分內(nèi)容系統(tǒng)闡釋，首先簡單介紹了

2、蟾毒靈對多種癌癥的抗腫瘤活性，其次簡單綜述了蟾毒靈相關(guān)納米制劑研究進展以及聚氰基丙烯酸烷酯類載體在藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的應(yīng)用。這兩個部分內(nèi)容契合本課題的研究內(nèi)容，為后續(xù)實驗工作的展開提供了理論依據(jù)。
　　第二項處方前研究
　　處方前研究建立了蟾毒靈HPLC體外分析方法，實驗結(jié)果顯示此方法具有較好的專屬性，1、10、20μg/mL三個濃度的蟾毒靈樣品日間精密度及日內(nèi)精密度分別為1.442％與1.846％、0.692％與1.286％以及

3、0.450％與0.256％，平均回收率依次為100.728±0.347％，100.767±1.128％和95.642±0.271％，各自的RSD％均小于2％，精密度與準(zhǔn)確度較高，定量限為100 ng/mL，檢測限為40ng/mL。高、中、低濃度的蟾毒靈樣品溶液在4℃條件下儲存72h，穩(wěn)定性良好。室溫條件下，蟾毒靈在水中的表觀溶解度為40.406±0.852μg/mL;酸穩(wěn)定性結(jié)果顯示蟾毒靈長時間處于酸性條件下會降解。但6h內(nèi)穩(wěn)定性仍較好

4、。
　　第三項制備優(yōu)化及質(zhì)量評價
　　本部分制備蟾毒靈聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒(BF-PBCA-NPs)，并以此為內(nèi)殼，以熊去氧膽酸修飾的牛血清白蛋白為親水外殼，制備蛋白聚合物“觸發(fā)式”納米載體(PPN)。利用單因素及中心復(fù)合設(shè)計法優(yōu)化處方:BCA=60μL和F127∶PVA=1∶1（W/W，M總=150mg）。最佳工藝驗證結(jié)果顯示，BF-PBCA-NPs的包封率為71.287±2.303％，藥物濃度為499.011±16.

5、123μg/mL，平均粒徑為149.3±0.6nm;蟾毒靈蛋白聚合物“觸發(fā)式”納米載體(B-PPN)的包封率為69.185±3.047％，藥物濃度為484.295±21.327μg/mL，平均粒徑為155.2±0.3nm，蛋白載負(fù)率高達94.406±1.651％。所制得的BF-PBCA-NPs及B-PPN大小較為均勻，呈規(guī)則圓球形，B-PPN表面較為光滑。物理化學(xué)表征結(jié)果:DSC圖譜顯示蟾毒靈是以無定型形態(tài)存在于納米載體中，F(xiàn)TIR圖譜

6、表明蟾毒靈是共價結(jié)合在納米載體的內(nèi)部，而不是吸附在載體表面。體外釋放試驗結(jié)果顯示以PBCA納米粒作為藥物載體具有緩釋作用，在納米粒外表面包裹修飾蛋白可增強緩釋作用。
　　第四項藥物動力學(xué)及用藥安全性研究
　　建立HPLC分析法用于體內(nèi)藥物動力學(xué)研究，并研究各制劑的用藥安全性以及在大鼠體內(nèi)的藥物代謝情況。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示所建立的HPLC分析法滿足測定要求。溶血性試驗與血管刺激性試驗均證實PBCA納米載體能夠增強用藥安全性，P

7、BCA納米載體表面包裹修飾蛋白，生物相容性最好。體內(nèi)藥物動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)納米粒制劑組SD大鼠體內(nèi)各時間點所對應(yīng)的血藥濃度均比蟾毒靈原料藥組所對應(yīng)的血藥濃度高，蟾毒靈原料藥組半衰期為1.821±0.223h，而BF-PBCA-NPs以及B-PPN的體內(nèi)半衰期分別為4.349±0.343h與5.495±0.193h，在同等給藥劑量下，BF-PBCA-NPs的平均滯留時間是蟾毒靈游離藥的1.506～2.867倍，而B-PPN的平均滯留時間是蟾毒

8、靈游離藥的1.880～3.361倍，兩者的生物利用度依次為262.218％與359.398％。
　　第五項組織分布學(xué)
　　建立HPLC分析法用于組織分布學(xué)研究，并研究各制劑在小鼠體內(nèi)組織分布情況。所建立的色譜條件不會干擾小鼠生物樣品中蟾毒靈及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的測定，專屬性良好，且小鼠血漿以及心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等組織中所檢測的蟾毒靈在0.05～5μg/mL濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性。日內(nèi)、日間精密度分別為1.182％-5.993

9、％與0.722-9.327％，小鼠血漿樣品及組織樣品中蟾毒靈的平均方法回收率為82.811-100.481％，平均絕對回收率為80.510-96.798％，RSD均小于10％，具有較高的精密度及準(zhǔn)確度，可用于含量測定。最低定量限為65.0ng/mL，最低檢測限為33.5ng/mL，蟾毒靈小鼠血漿樣品以及心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等各組織樣品在72h內(nèi)穩(wěn)定。蟾毒靈原料藥、BF-PBCA-NPs與B-PPN的組織藥物濃度依次為心＞腎＞肝＞肺＞

10、脾＞腫瘤，腎＞肝＞肺＞腫瘤＞心＞脾以及腎＞肺＞肝＞脾＞腫瘤＞心。制劑組各時間點的血藥濃度均顯著比原料藥組高(P＜0.05)。PPN與PBCA納米載體可以減少蟾毒靈在心臟的分布，蟾毒靈制劑在心臟組織的藥物濃度與原料藥相比較低，且無時間依賴性，基本維持在0.2μg/g以下。制劑組在肝、脾、肺等器官的組織藥物濃度均比原料藥組高，且B-PPN組在這幾個組織所檢測到的藥物含量均高于BF-PBCA-NPs組，說明B-PPN能夠比BF-PBCA-NP

11、s更好的發(fā)揮器官靶向性。
　　第六項體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)與心臟毒性研究
　　該部分主要研究蟾毒靈原料藥以及蟾毒靈制劑在ICR荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤抑制作用與對心臟的毒性作用。蟾毒靈原料藥、BF-PBCA-NPs以及B-PPN均具有不同程度的抗腫瘤作用，在給藥量相同的情況下，BF-PBCA-NPs組與B-PPN組的腫瘤體積生長速度比蟾毒靈原料藥組緩慢，B-PPN組荷瘤小鼠的腫瘤生長速度最慢，腫瘤抑制率結(jié)果顯示BF原料藥組的抑瘤率為48