新西蘭青霉界面培養(yǎng)產(chǎn)紅色素技術(shù)的建立及產(chǎn)紅色素菌絲的轉(zhuǎn)錄組測序.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室在新西蘭青霉（Penicillium novae-zeelandiae）紅色素研究領(lǐng)域有著良好的基礎(chǔ)，在利用二元發(fā)酵及青霉純培養(yǎng)生產(chǎn)紅色素方面做了一系列探索，但研究多集中于發(fā)酵條件優(yōu)化與產(chǎn)量的提高，對(duì)于紅色素的產(chǎn)生機(jī)制及色素組分結(jié)構(gòu)仍不清楚。從前人的研究中，發(fā)現(xiàn)P.novae-zeelandiae具有很強(qiáng)的紅色素產(chǎn)生能力，因此本論文在研究如何提高青霉HSD07B純培養(yǎng)產(chǎn)生紅色素的基礎(chǔ)上（包括最佳產(chǎn)紅色素培養(yǎng)技術(shù)的建立和條件優(yōu)化）

2、，進(jìn)行了青霉HSD07B產(chǎn)紅色素菌絲的轉(zhuǎn)錄組測序分析，以期能揭示紅色素的產(chǎn)生機(jī)理，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)紅色素提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。
　　經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，青霉HSD07B在液體搖床發(fā)酵中并不產(chǎn)紅色素，只有當(dāng)將其靜置培養(yǎng)形成菌膜后，才有紅色素的產(chǎn)生。方法如下:以1 mL的接種量(孢子懸液濃度為2×107個(gè)/mL)，接種于300mL初始pH為6的PD培養(yǎng)基內(nèi)，先于30℃、150r/min恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩培養(yǎng)40 h，之后靜置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行靜

3、置的界面菌膜培養(yǎng)。靜置24 h便可形成產(chǎn)紅色素菌膜，且初始產(chǎn)紅色素速率很快，一直持續(xù)到發(fā)酵的第7d，之后產(chǎn)紅色素速率變得平緩，一般在第9d發(fā)酵液中色素濃度達(dá)到最大。同時(shí)為了后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序的取樣需求，本研究又建立了一種新的有支持物的界面菌膜培養(yǎng)法。對(duì)于有支持物的界面菌膜培養(yǎng)法，則是在上述培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，搖床振蕩培養(yǎng)40h后，將一片無菌濾膜懸浮置于發(fā)酵液表面，之后30℃靜置培養(yǎng)，使發(fā)酵液內(nèi)的菌絲以濾膜為附著物形成產(chǎn)紅色素菌膜，使轉(zhuǎn)錄組測序

4、的取樣變得簡便。
　　取產(chǎn)紅色素初期的紅色菌絲T1，產(chǎn)紅色素旺盛時(shí)期的紅色菌絲T2，以及它們所對(duì)應(yīng)時(shí)期的振蕩培養(yǎng)的非產(chǎn)紅色素菌絲Ck1與Ck2，通過Illumina平臺(tái)進(jìn)行無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測序，共得到16 G的測序數(shù)據(jù)，有21，204，700，934個(gè)reads，平均每個(gè)樣本約有53億個(gè)reads。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到unigenes10621條。在這些基因中共有772個(gè)SNP位點(diǎn)和6475個(gè)SSR，得到有GO注釋的u

5、nigenes共5496條，獲得KEGG注釋的unigenes有3086條，這將是后續(xù)基因表達(dá)差異分析的源數(shù)據(jù)。
　　對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Ck1與T1之間有表達(dá)差異基因1148個(gè)，其中上調(diào)基因823個(gè)，下調(diào)基因325個(gè)。Ck2與T2之間有表達(dá)差異基因1789個(gè)，其中上調(diào)基因1257個(gè)，下調(diào)基因532個(gè)。通過差異基因的注釋及分析，發(fā)現(xiàn)T1與Ck1的表達(dá)差異中有多個(gè)有關(guān)氧化還原功能的基因發(fā)生了變化，還有其有關(guān)膜方面的功能基因表達(dá)有

6、所上調(diào)，這些基因都在形成菌膜初期被發(fā)現(xiàn)，可能是為了適應(yīng)發(fā)酵方式的改變，與形成菌膜有關(guān)。在T2與Ck2的比對(duì)分析中，發(fā)現(xiàn)T2的紅霉內(nèi)酯合成酶活性、過渡金屬離子結(jié)合功能、四吡咯結(jié)合功能、亞鐵血紅素結(jié)合功能、單加氧酶活性、鐵離子結(jié)合功能等相關(guān)基因的表達(dá)有顯著的上、下調(diào)，由于T2是處于產(chǎn)紅色素的旺盛時(shí)期，所以這些基因很可能參與紅色素的產(chǎn)生過程。并且，通過KEGG通路差異分析發(fā)現(xiàn)，在T1與Ck1和T2與Ck2的差異通路中，多環(huán)芳烴的降解通路都具有