新型核苷衍生物的設(shè)計、合成及抗HBV活性研究.pdf

1、乙型肝炎是一種常見的嚴重肝臟疾病，由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起。據(jù)統(tǒng)計，世界上超過2.4億人為慢性乙型肝炎患者，導(dǎo)致每年約78萬人死于肝臟類疾病，如肝硬化、肝癌或其他相關(guān)疾病。目前，用于治療慢性乙型肝炎的藥物主要有兩類：干擾素類免疫調(diào)節(jié)制劑和核苷（酸）類病毒聚合酶抑制劑。然而，干擾素治療僅對60％的患者有效，并且副作用出現(xiàn)頻繁，注射條件受限。與干擾素相比，核苷（酸）類似物有以下優(yōu)勢：口服生物利用度高、副作用少以及臨床效益較高，但長時

2、間使用核苷（酸）類藥物會增加耐藥性和副作用發(fā)生的幾率，導(dǎo)致治療失敗。盡管如此，核苷（酸）類抗病毒藥物仍是目前最有發(fā)展前景的慢性乙型肝炎治療藥物。
　　本論文在我們課題組前期研究工作的基礎(chǔ)上，從以下兩個方面對核苷類似物進行結(jié)構(gòu)修飾及抗HBV活性研究：
　　(1)為了解決核苷類似物FNC（2'-脫氧-2'-β-氟-4'-疊氮胞苷）的抗HBV毒性問題，我們根據(jù)FNC的構(gòu)效關(guān)系設(shè)計并合成了一系列4-N-烷基取代的氟代核苷類似物2-2

3、0?2-30。我們以合成FNC的重要中間體2-17為原料，經(jīng)過3步反應(yīng)得到目標產(chǎn)物，并對這些新型核苷類似物進行了1H NMR、13C NMR及HRMS等結(jié)構(gòu)表征，并利用X單晶衍射對化合物2-25的結(jié)構(gòu)進一步進行確認。另外，經(jīng)HPLC分析，目標化合物的純度均在95%以上。
　　通過對新型核苷類似物2-20?2-30在細胞株HepG2.2.15中的毒性測試及在細胞株HepG2.CW中的活性測試篩選出環(huán)丙胺衍生物2-25，并對其進一步進

4、行體內(nèi)抗 HBV活性研究。急性毒性實驗結(jié)果顯示，在昆明小鼠中，化合物2-25表現(xiàn)出明顯的毒性改善作用，化合物2-25的口服劑量可達到3 g/kg。通過昆明小鼠的白細胞毒性及誘變效應(yīng)評估可知，化合物2-25對白細胞無顯著毒性，并且，在單次給藥80 mg/kg或連續(xù)5天每天給藥20 mg/kg時，昆明小鼠幾乎無誘導(dǎo)效應(yīng)。在DHBV感染的鴨模型中，連續(xù)10天每天給藥1 mg/kg后，檢測發(fā)現(xiàn)化合物2-25對鴨血清和肝臟中DHBV DNA抑制率

5、分別為74.2%和82.1%，并且停藥3天后僅發(fā)現(xiàn)有輕微反彈現(xiàn)象。通過對SD大鼠進行藥代動力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)化合物2-25生物利用度（F）不高，其F值為18.7±7.5%。另外，我們還對化合物2-25在生物體內(nèi)的活性分子2-25的三磷酸分子（2-25-TP）與HBV聚合酶的相互作用分子模型進行了分析，發(fā)現(xiàn)2-25-TP與活性位置結(jié)合完好并在氫鍵和鹽橋的相互作用下能穩(wěn)定存在，與前面活性測試結(jié)果吻合。分子模型的建立有利于指導(dǎo)我們設(shè)計具有抗HBV

6、活性的新型化合物。
　?。?）為了減少核苷類藥物的耐藥性和副作用發(fā)生的幾率，提高聯(lián)苯雙酯的生物利用度，在本題組抗病毒藥物核苷類似物及具有保肝活性的聯(lián)苯類化合物的研究基礎(chǔ)上，采用“Codrug”新藥研發(fā)策略，合成了一系列新型核苷-聯(lián)苯雙酯化合物3-23?3-50，并對這些新型核苷類似物進行了1H NMR、13C NMR、HRMS或IR等結(jié)構(gòu)表征。
　　通過對化合物3-23?3-50在細胞株HepG2.2.15中的毒性及初步活性

7、測試實驗，篩選出3個低毒、高活性的化合物（3-29、3-40及3-43），它們的CC50值分別為965.4μM、1546.5μM和436.16μM。我們對這3個化合物分別進行進一步體內(nèi)外抗HBV活性研究：對細胞株HepG2.2.15上清液中HBeAg及HBsAg分泌的抑制作用；對HepG2.2.15細胞內(nèi)外HBV DNA復(fù)制的抑制效應(yīng)；對DHBV感染的鴨模型療效評估（對 DHBV DNA復(fù)制的抑制作用、血清及肝臟中 ALT及AST水平的

8、檢測、組織病理學(xué)分析）。結(jié)果顯示，與陽性對照組3TC相比，3個化合物在低劑量情況下顯示出類似或者優(yōu)于3TC的抗 HBV活性，但化合物3-40及3-43在對鴨血清及肝組織內(nèi)的DHBV DNA復(fù)制的抑制作用評估中，停藥后DHBV DNA水平出現(xiàn)程度較大的反彈現(xiàn)象，而化合物3-29反彈程度較低。因此，我們接著對化合物3-29進行有關(guān)肝保護作用的實驗，在給藥5天后，通過檢測發(fā)現(xiàn)，化合物3-29在劑量組為150或300 mg/kg/d時均能明顯降