基于Tat底物校對監(jiān)控系統(tǒng)的巴氏醋桿菌乙醇脫氫酶的定向進化.pdf

1、醋酸菌在食醋工業(yè)化生產(chǎn)過程中的廣泛應用得益于其突出的高產(chǎn)酸、耐酸性能，而以吡咯喹啉醌(PQQ)為輔酶的乙醇脫氫酶(PQQ-ADH)在此過程中扮演著重要角色，因其能將乙醇氧化生成乙醛，進而在乙醛脫氫酶的作用下轉化成乙酸。本文以從浙江傳統(tǒng)玫瑰醋中分離得到的巴氏醋桿菌Ab3為出發(fā)菌株，借助Tat表達體系并融合抗性基因對其乙醇脫氫酶大亞基(AdhA)進行可溶性表達的探索和定向進化篩選，為周質蛋白基因的可溶性表達及功能篩選提供了方法論。基于生物信

2、息學分分析方法，本文首先對不同醋酸菌中的AdhA進行比對分析，包括信號肽預測，二級結構、三級結構的預測與分析等，闡述了不同醋酸菌中AdhA在序列上以及結構上的區(qū)別，同時指出可能且容易發(fā)生突變的影響AdhA活性的位點。在此基礎上構建AdhA的Tat-bla表達體系，結合易錯PCR的方法對巴氏醋桿菌AdhA進行了定向進化。
　　生物信息學結果表明，不同醋酸菌的AdhA上均存在一段含有雙精氨酸基序S-R-R-x-F-L-K的獨特信號肽，

3、能夠被細菌Tat表達系統(tǒng)識別，從而實現(xiàn)跨膜轉運。通過AdhA的氨基酸序列的比對及每個氨基酸位點的剖析可知，在巴氏醋桿菌Ab3的AdhA的氨基酸序列中，與高產(chǎn)酸、耐酸的Komagataeibacter相比較，Ala30Thr、Val31Met、Pro32Ala、Ala33Ser、Asp36Asp、Glu43Glu、Glu53Gly、Lys262Gln、Pro266Pro、Lys267Thr、Ser289Ala、Ile311Lys、Gln3

4、93Val、Leu402Lys、Lys457Thr、Glu508Ala、Thr509Glu、Val510Ala、Trp511Trp、Gly559Gly、Asp639Asp、Met662Val、Thr697Gly、Asn731Gly這些位點的改變可能會引起其二級結構的改變，預示著ADH的活性與這些位點有關，并進而影響醋酸菌的耐酸性。
　　在生物信息學分析的基礎上，成功克隆了adhA基因及氨芐抗性基因，構建了重組質粒pADH-Bla，

5、實現(xiàn)了adhA基因在大腸桿菌周質空間的可溶性表達和定向進化。利用大腸桿菌Tat表達系統(tǒng)的獨特優(yōu)勢，選用易錯PCR的方法對adhA基因定向進化，抗性平板篩選出氨芐抗性能力提高的突變菌株M14，M21，M28，M44，M59和M60。M14與M21的adhA基因有3個突變位點A158G，C290G，A784C，對應的氨基酸突變?yōu)镚lu53Gly，Ala97Gly，Lys262Gln。M28與M60的adhA基因的突變位點為A158G，C12

6、04G，對應的氨基酸突變?yōu)镚lu53Gly，Leu402Lys。其中M14和M28有共同的突變位點A158G。M44的adhA基因共有5個突變位點，分別為A129G，G643T，A1523C，C1677A和A1984G，對應的氨基酸突變?yōu)镚lu43Glu，Ala215S er，Glu508Ala，Gly559Gly和Met662Val。M59的adhA基因的突變位點為T473A，T1529C，對應的氨基酸突變?yōu)镻he158Tyr，Val