功能性聚合物的定點結合對蛋白質生物活性的調控.pdf

1、蛋白質生物活性的調控在人類健康和疾病治療中具有重要的意義。如何精確地控制蛋白質的結構和活性等生物學性能是解決其在疾病治療、分子診斷和組織工程等生物醫(yī)學領域中應用問題的關鍵。利用聚合物對蛋白質進行改性從而提高蛋白質性能的研究受到越來越廣泛的關注。聚合物與蛋白質表面的定點結合可以得到結構可控的蛋白質-聚合物偶聯物，其中聚合物的性質以及在蛋白質表面的引入位點是關系其最終應用性能的重要因素。
　　本論文的主要工作是制備多種功能性聚合物定點

2、改性的蛋白質，系統研究聚合物的種類及其與蛋白質的結合位點對蛋白質生物學性能的影響。具體研究內容如下：
　　首先，制備了一系列不同位點處含有巰基的模型蛋白質。通過基因重組的方法獲得了野生型無機焦磷酸酶（PPase），通過基因定點突變的方法在PPase表面特定位點處引入半胱氨酸殘基，制備了一系列在不同位點處含有巰基的突變型PPase，并最終作為聚合物定點結合的蛋白質模型。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）表征表達純化的PP

3、ase及其突變體的純度，通過測定PPase催化焦磷酸鈉水解生成正磷酸鹽的含量表征PPase及其突變體的活性，通過Ellman法測定PPase及其突變體的自由巰基含量。結果表明：通過突變基因的構建以及突變體蛋白質的表達純化我們獲得了純度極高的突變體蛋白質，并成功在蛋白質表面的不同位點處引入一個可自由反應的巰基，突變型PPase的活性與突變位點的位置和氨基酸殘基種類有關，但總體來說，雖然活性有一定的變化，但這種變化并不會對其后續(xù)的研究產生重

4、要的影響，因此獲得的突變體蛋白質可以用于下一步研究。
　　然后，制備了生物相容性聚合物聚甲基丙烯酸羥乙酯（pHEMA）與 PPase的偶聯物，研究了pHEMA的引入對蛋白質活性和構象的影響，并與小分子巰基修飾試劑對氯汞苯甲酸（PCMB）對蛋白質的影響進行了比較。利用吡啶二硫基功能化的原子轉移自由基聚合（ATRP）引發(fā)劑引發(fā)ATRP聚合制備末端基團功能化的pHEMA；通過核磁共振氫譜（1HNMR）和凝膠滲透色譜（GPC）對聚合物的分

5、子量以及分子量分布進行表征；通過吡啶二硫基功能化pHEMA與靠近活性中心特定位點處含有巰基的突變型PPase（PPaseK148C）之間的化學結合將pHEMA偶聯到PPase活性中心附近；通過SDS-PAGE和動態(tài)光散射（DLS）表征PPase-pHEMA偶聯物的形成；通過活性測定研究PCMB和pHEMA的引入對PPase活性的影響；通過還原劑的還原處理研究 pHEMA和 PCMB對 PPase活性的可逆調控；通過圓二色譜（CD）對 P

6、CMB和pHEMA偶聯前后PPase的構象變化進行表征。結果表明：PCMB和pHEMA在PPase表面的引入可以抑制蛋白質的活性，而 pHEMA的引入對蛋白質活性的抑制程度更大。這種抑制作用可以通過不同還原劑的處理而得以消除。并且，這種 PCMB和pHEMA偶聯對PPase活性的抑制以及還原劑處理對活性的恢復具有明顯的可逆性。PCMB和pHEMA對蛋白質活性的影響是由于其造成了蛋白質三級結構的變化。與小分子 PCMB相比，聚合物pHEM

7、A的結合對蛋白質三級結構的改變更大。還原劑對PPC-PCMB和PPC-pHEMA偶聯物活性的恢復是由于其引起PCMB和pHEMA從蛋白質表面的解離，從而使得蛋白質的構象得以恢復。這一蛋白質活性調節(jié)的策略有望應用于生物檢測、藥物釋放以及細胞功能調節(jié)等領域。
　　其次，制備了pH響應性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（pDMAEMA）與PPase的偶聯物，并研究了pDMAEMA在蛋白質表面不同位點處的引入對蛋白質活性和pH穩(wěn)定性

8、的影響。通過可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT）聚合合成不同分子量的pDMAEMA并利用二硫二吡啶后修飾的方法實現其末端基團的吡啶二硫基功能化；通過1HNMR和GPC對聚合和后修飾反應進行表征；通過pDMAEMA末端吡啶二硫基團與突變型 PPase表面巰基之間的結合分別將聚電解質 pDMAEMA偶聯到 PPase表面靠近活性中心（PPaseK148C）以及遠離活性中心（PPaseN124C）的特定位點；通過Native PAGE表征PPas

9、e-pDMAEMA偶聯物的形成；通過不同pH條件下偶聯物的粒徑和Zeta電勢表征pDMAEMA的引入對PPase電荷狀態(tài)和聚集狀態(tài)的影響。結果表明：pDMAEMA在蛋白質表面不同位點處的引入對其活性具有不同的影響?？拷钚灾行臅r蛋白質活性受到較為嚴重的影響，而遠離活性中心時對蛋白質活性的影響較小，且在酸性pH下的活性有一定程度的提高。不同分子量pDMAEMA在蛋白質表面遠離活性中心位點處的引入均能提高蛋白質在酸性環(huán)境中的活性，聚合物分子

10、量越大活性提高的程度越大。pDMAEMA對蛋白質活性的影響是由于其改變了蛋白質的表面電荷狀態(tài)。聚合物的引入有效防止了蛋白質在pH為4.0到6.0范圍內的聚集，使得蛋白質在酸性環(huán)境下的活性顯著提高。這種在蛋白質表面特定位點處引入聚電解質鏈的方法為提高蛋白質在極端pH條件下的穩(wěn)定性提供了新策略。
　　最后，制備了糖聚物聚丙烯酰胺基葡萄糖（pAG）和聚甲基丙烯酰胺基葡萄糖（pMAG）與PPase的偶聯物，研究和比較了兩種不同類型和分子量

11、的糖聚物對蛋白質表面不同位點的修飾對蛋白質活性的影響。通過 RAFT聚合的方法制備兩種糖聚物pAG和pMAG；通過二硫二吡啶后修飾的方法將糖聚物末端基團轉化成吡啶二硫基團；通過1HNMR和GPC對聚合和后修飾反應進行表征；通過糖聚物pAG和pMAG吡啶二硫基團與突變型PPase巰基之間的化學偶合分別將pAG和pMAG偶聯到PPase表面靠近活性中心（PPaseK148C）以及遠離活性中心（PPaseN124C）的特定位點，通過SDS-P

12、AGE表征PPase-糖聚物偶聯物的形成。結果表明：糖聚物在蛋白質表面的引入位點對其活性具有極其重要的影響，靠近活性中心結合時蛋白質活性降低，遠離活性中心結合時蛋白質活性提高。對于同種糖聚物pAG，分子量不同時對蛋白質的活性影響也有所不同?？拷钚灾行臅r分子量較大的糖聚物降低蛋白質活性的程度較大，而遠離活性中心時分子量較小的糖聚物提高蛋白質活性的程度較大。分子量相當的不同糖聚物pAG和pMAG對蛋白質活性的影響沒有顯著差異。這一結果對蛋