茶樹黃酮醇糖苷積累的研究及CsFLS基因功能的驗證.pdf

1、茶樹多酚類物質是茶湯風味形成的主要成分，其中黃酮醇糖苷在茶的澀味中扮演著重要角色。茶樹中游離的黃酮醇很少，多與糖基結合，形成黃酮醇糖苷類形式存在。黃酮醇合成酶基因（FLS）是黃酮醇合成的直接關鍵酶，與黃酮醇糖苷的積累是緊密相關的。本文首先對茶樹中的黃酮醇糖苷進行了定性和定量分析，為進一步探索茶樹中黃酮醇糖苷含量變化機理，本文還對茶樹黃酮類物質積累的關鍵基因黃酮醇合成酶（FLS）的功能進行了驗證。主要研究結果如下：
　　1．茶樹中黃

2、酮醇糖苷的定性和定量分析。利用HPLC-TOF-MS鑒定了茶樹鮮葉中15種黃酮醇糖苷；利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立了這些黃酮醇糖苷的定量方法；并通過六個黃酮醇糖苷的標準品對定量方法進行了評估，結果表明，在一定的濃度范圍內，回歸方程都具有很好的線性關系(R2>0.99)；最低檢測限和最低定量限分別小于0.01和0.03ng；回收率在90％和105%之間；保留時間和峰面積變化的日內相對標準差分別小于0.15%和3.9%；

3、日間相對標準差分別小于0.26%和4%。表明該方法具有較高的靈敏度、良好的精密度和重現性。
　　利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立的定量方法，研究了四個不同茶樹品種不同組織發(fā)育階段的黃酮醇糖苷的含量變化。相對定量結果發(fā)現，黃酮醇單糖苷，雙糖苷和三糖苷主要積累在嫩葉中，少量積累在芽、成熟葉和幼莖中，其中槲皮素-3-O-蕓香糖苷在成熟葉和幼莖中含量也很高。絕對定量結果發(fā)現，其中6種黃酮醇糖苷在不同組織發(fā)育階段的絕對含量變

4、化與相對定量的結果一致，主要積累在嫩葉中。此外，我們還發(fā)現這六個黃酮醇糖苷在老莖和根中的含量極少。
　　2茶樹黃酮醇合成酶功能的研究。本文克隆了3條茶樹黃酮醇合成酶（CsFLS）基因，利用RT-PCR技術定量分析了3條CsFLS基因在不同組織發(fā)育階段和不同誘導處理下的表達水平差異，結果表明，3條CsFLS基因在芽、一葉、二葉、成熟葉和3幼莖中都有表達；其中CsFLS1基因在芽中表達量最高，而CsFLS2和CsFLS3基因在二葉中表

5、達量最高，它們在成熟葉和莖中表達量都較低；3條CsFLS基因的表達都受蔗糖和ABA誘導明顯上調，而其他處理條件下，CsFLS基因表達量變化都不明顯。
　　為進一步驗證它們的功能，實驗將3條CsFLS基因整合到pRSFDuet-1載體上，構建成帶組氨酸（His）標簽的重組融合表達載體，并導入BL21大腸桿菌表達，再利用Ni柱純化獲得重組融合蛋白。HPLC體外酶活檢測結果顯示，3條重組CsFLS融合蛋白均可分別以DHK、DHQ和DHM

6、為底物催化K、Q和M的產生；CsFLS2融合蛋白對于DHK、DHQ和DHM的Km值分別為22.9μM，80μM和65.55μM。構建了EHA105-pCB2004-CsFLS2載體，并利用農桿菌介導侵染煙草葉片，通過除草劑篩選獲得了轉基因植株。檢測結果發(fā)現，轉CsFLS2基因的煙草相比野生型，其花色明顯變淺，花青素含量明顯降低，而黃酮醇糖苷的含量增加。進一步在本氏煙幼苗葉片組織中瞬時表達帶有GFP的CsFLS2基因，發(fā)現CsFLS2定位