恰塔努加鏈霉菌納他霉素高效生物合成的分子機制.pdf

1、納他霉素是一類多烯類抗生素，在食品和醫(yī)療上被廣泛用作抗真菌劑，由于工業(yè)菌發(fā)酵水平較低，限制其廣泛應用。納他霉素合成過程為典型的I型PKS途徑，但其系列合成反應如何高效鏈接、形態(tài)分化與合成途徑如何協(xié)同等機制至今未有清晰解析，本研究以納他霉素工業(yè)菌株恰塔努加鏈霉菌L10為研究對象，對其高效生物合成的分子機制進行較為深入的研究，同時為工業(yè)菌高產(chǎn)改造提供了理論依據(jù)。
　　首先解析了納他霉素合成途徑的后修飾機制。通過對其中5個后修飾酶編碼基

2、因進行遺傳改造，獲得了4，5-脫環(huán)氧脫糖納他霉素、4，5-脫環(huán)氧納他霉素、4，5-脫環(huán)氧-12-脫羧基-12-甲基納他霉素及其脫水化合物等納他霉素類似物，其中后2個為新化合物。生物指示試驗結果顯示，其中后3個類似物具有一定的抗真菌活性。scnD的缺失株不產(chǎn)生納他霉素但積累高產(chǎn)量的4，5-脫環(huán)氧納他霉素，scnK、scnJ和scnC的缺失株均不產(chǎn)生納他霉素而累積大量的4，5-脫環(huán)氧脫糖納他霉素。scnG的缺失株也不產(chǎn)納他霉素，而產(chǎn)生4，5

3、-脫環(huán)氧-12-脫羧基-12-甲基納他霉素及其脫水化合物。此外，scnG相連的scnF缺失株中納他霉素產(chǎn)量降低了53％，同源糖基轉移酶基因amphDI和nysDI可以部分回補scnK的功能。研究結果表明，納他霉素合成過程中ScnG、ScnK和ScnD依次催化羧基化、糖基化和環(huán)氧化修飾，后修飾機理的揭示進一步充實了納他霉素生物合成途徑機制。
　　微生物本身的生物經(jīng)濟學原理總是限制每種次級代謝產(chǎn)物的過度合成，特別是野生菌的PKS途徑自

4、然設立了許多限速步驟。因此揭示合成途徑限速步反應，改造關鍵合成元件的適配性，是建立高速生物合成途徑的關鍵。本研究成功建立了鏈霉菌梯度誘導表達體系，用于鑒定納他霉素合成途徑中潛在的限速步驟。以誘導型啟動子OROlac和強啟動子ermEp*為基礎，在沒有誘導劑的條件下，OROlac的表達受到LacI蛋白的阻遏;當加入誘導劑IPTG時，LacI對OROlac阻遏得到解除。利用這一模型，首先在鏈霉菌L10中導入抑制型的egfp質粒，進行誘導表達

5、，Western blotting和qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示其表達量隨著IPTG的升高逐漸升高直至最大值，且在相對較寬的誘導濃度范圍內保持一定的誘導表達量。在此基礎上，構建了一系列scnK、scnJ、scnC和scnD的回補菌株，體內穩(wěn)態(tài)動力學分析顯示，納他霉素的產(chǎn)量隨著它們的表達量的升高而升高，從而揭示了納他霉素合成途徑中糖基化和環(huán)氧化修飾步驟是限速步驟，其對應的催化酶是限速酶，且在我們體內穩(wěn)態(tài)動力學分析范圍內這些酶的催化活性并未出現(xiàn)飽

6、和狀態(tài)和抑制現(xiàn)象。
　　針對上述限速反應節(jié)點及其對應的關鍵酶的穩(wěn)態(tài)動力學曲線，采用鏈霉菌常用的強表達啟動子ermEp*，在L10中分別高表達scnK、scnD、scnJ和scnC基因，納他霉素的產(chǎn)量均有顯著的提高，而且其累積的中間代謝產(chǎn)物大幅降低。組合高表達scnKJC和scnKJCD后，納他霉素產(chǎn)量進一步提高，兩者累積的中間代謝產(chǎn)物均顯著下降，獲得的高產(chǎn)菌株在YEME中納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高了147％，在工業(yè)培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)量提高了

7、232％。50 L發(fā)酵罐小試中，以還原糖濃度≈2％、溶氧≥30％、pH6.3作為發(fā)酵工藝放大的關鍵參數(shù)，發(fā)酵164 h時，最高產(chǎn)量達到15.7 g/L。因此通過增強限速步驟中關鍵酶基因的表達量，減少中間代謝產(chǎn)物的累積，消除限速步驟，是建立微生物藥物高速生物合成通路的關鍵。
　　微生物藥物生物合成途徑受到調控網(wǎng)路的復雜調控，其中菌體生長量往往和次級代謝產(chǎn)量關聯(lián)耦合，而sigma因子在轉錄水平上對鏈霉菌形態(tài)分化和次級代謝過程起協(xié)同調控

8、作用，但該機制未有針對性的闡析。本研究選擇L10中第三類sigma因子WhiGch，對其多效調控機制進行研究。whiGch的缺失株生長變慢導致納他霉素的產(chǎn)生延遲24 h，并且納他霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌下降了30％，whiGch高表達菌在工業(yè)培養(yǎng)基中產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了26％; WhiGch正調控納他霉素生物合成途徑，同時抑制migrastatin和jadomycin類似物生物合成基因簇基因表達。凝膠阻滯實驗表明WhiGch可直接結合到納他霉素基