基于功能化石墨烯新型DNA生物傳感器的構建及在腫瘤檢測中的研究.pdf

1、隨著工業(yè)化進程日益加快，環(huán)境污染日漸嚴重以及人口老齡化不斷加速，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率也在快速攀升，已然成為威脅人類健康的頭號殺手。因為惡性腫瘤的早期患者所治愈的可能性遠遠大于晚期患者,而且要節(jié)省更多的財力、人力和時間,倘若腫瘤發(fā)生能夠及時被檢測，這對于提高腫瘤治愈率和延長患者生存期具有重要的臨床意義。隨著對基因結構和功能研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤等重大疾病都與遺傳基因有關?；駾NA分子的結構序列發(fā)生微小改變，都會導致遺傳

2、信息的改變或疾病的發(fā)生。通過對與腫瘤發(fā)生相關的基因序列檢測，對腫瘤的早期診斷、監(jiān)測和治療方面具有重要臨床應用價值。
　　基于納米技術、生物傳感技術和電化學分析技術，本研究構建了一系列在腫瘤早期篩查和診斷中具有重要應用前景的高靈敏電化學DNA生物傳感器。從功能化石墨烯納米材料的制備，傳感器敏感界面的構建以及新型信號增強的DNA傳感器的研制，并研究新方法及其應用等方面進行了探索和研究，為惡性腫瘤的早期檢測以及相關研究提供新的思路。本論

3、文主要開展的工作及結果如下：
　?、倩?GO-COOH/ CuO NWs構建的DNA生物傳感器對肺癌相關基因CYFRA21-1的檢測
　　制備羧基功能化石墨烯（GO-COOH）以改善rGO的分散性和生物相容性，再合成氧化銅納米線（CuO NWs），并充分結合二者的優(yōu)勢，通過簡單的混合使其相互交織纏繞形成網狀結構，這種方法避免了將兩者進行復合的繁瑣合成步驟，且復合物中的CuO NWs充當電子傳遞“導線”，能夠促進電極的電子傳

4、遞速率。對所制備的GO-COOH/CuO NWs復合材料進行SEM、TEM、EDX和FTIR表征和電化學性能測試。將5’端修飾有-NH2的CYFRA21-1探針分子通過酰胺共價固定到GO-COOH/CuO NWs工作電極表面。采用 MB做雜交指示劑，利用ssDNA/GO-COOH/CuO NWs/PLLy/GCE構建的電化學DNA傳感器對CYFRA21-1基因的人工合成序列進行檢測。研究結果表明該傳感器在1.0×10-6~1.0×10–

5、12 mol/L的濃度范圍內與電化學響應信號呈良好線性關系，以及良好的選擇性和穩(wěn)定性。
　?、跇嫿?NG/AuNPs DNA生物傳感器并檢測 HL-60人原髓白血病細胞的MDR1基因
　　采用元素摻雜的方法進一步改善石墨烯的電化學活性。對GO進行N原子摻雜，再將Au3+原位還原到NG中，從而得到NG/AuNPs復合材料，再利用強烈的S-Au鍵將巰基修飾的MDR1基因探針固定在傳感器NG/AuNPs修飾電極表面。利用SEM、T

6、EM、XRD和XPS對材料的理化特性進行了表征?；贜G/AuNPs的優(yōu)異的電催化能力和生物相容性，構建的電化學DNA傳感器對MDR1基因人工合成序列的最低檢出限為3.12×1015mol/L。構建的DNA生物傳感器在腫瘤實際樣品檢測中進行了初步應用。利用構建的NG/AuNPs DNA生物傳感器檢測HL-60人原髓白血病細胞的MDR1基因的RT-PCR產物，并將實驗結果與分子生物學中最常用的PCR法相比較，結果表明建立的NG/AuNPs

7、電化學DNA傳感器檢測方法速度更快、靈敏度更高，在臨床上實現(xiàn)對白血病多藥耐藥相關基因 MDR1的檢測方面具有良好的應用潛力。
　?、刍?D NG/Fe3O4構建的新型DNA生物傳感器研究
　　在上一章的研究基礎上，整合2D石墨烯制備具有三維（3D）泡沫結構的功能化石墨烯。采用環(huán)保綠色,操作簡便的一步水熱法自組裝合成三維石墨烯-四氧化三鐵水凝膠(3D NG-Fe3O4)材料，對其三維結構形成機理進行探討。功能化的3D NG不

8、僅保持了石墨烯固有的品質，而且在電催化反應和導電材料等方面具有相對二維（2D）石墨烯材料更優(yōu)越的性能，比如高孔隙率、高活性比表面積、柔韌性以及更優(yōu)異的導電性等。各種技術（SEM、TEM、EDX和 XPS）被用來表征3D NG-Fe3O4的結構和組成，并在最優(yōu)化實驗條件下運用3D NG-Fe3O4修飾的生物傳感器與目標DNA雜交反應并靈敏度分析。采用標準加樣法研究了3D NG/Fe3O4修飾的生物傳感器在白血病人血清環(huán)境中分析檢測MDR1

9、基因序列的能力，分別在TE buffer溶液，1％人血清，5%人血清中均具有良好的檢測識別能力，抗干擾性較好。
　?、?D GF/Ag NPs電化學DNA傳感器的構建并用于非小細胞肺癌CYFRA21-1基因RT-PCR酶切產物的檢測
　　采用化學氣相沉積法(CVD)，以CH4為碳源，泡沫鎳為三維模板和催化劑，制備結構更加立體和均勻的3D石墨烯材料，利用SEM、TEM、EDX及接觸角檢測對材料的理化特性進行表征。證明制備的3D

10、 GF是高品質、幾乎無缺陷的。再利用電沉積法將銀納米顆粒（Ag NPs）復合到3D GF的三維立體碳骨架上，使完美的三維網格結構表面覆蓋一層具有優(yōu)異性能的Ag NPs并改善3D GF親水性。通過考察電位掃描速度與ssDNA/3D GF/AgNPs/GCE的電化學響應的關系，探討其修飾電極表面的動力學機理，證明了3D GF/AgNPs穩(wěn)定立體的多孔貫通結構，不僅極大的增大電極的有效面積，也為ssDNA探針序列在電極表面的負載提供了有利條件

11、，3D GF/AgNPs是一個新穎的、有前途的電化學DNA傳感器修飾材料。基于3D GF/AgNPs構建的電化學DNA傳感器對非小細胞肺癌基因CYFRA21-1實際樣品的檢測效果滿意，證明該方法的準確性。
　?、?DNA標記的三明治型生物傳感器對乳腺癌MCF-7細胞的檢測研究
　　制備一種三明治型免疫傳感器用于電化學測定人乳腺癌 MCF-7細胞的檢測，并結合電化學生物傳感器和DNA修飾抗體的優(yōu)點。首先用3D GF作為理想的電

12、極底層材料，再利用金納米籠功能化 MWCNT材料作為乳腺癌 ER蛋白抗體（antibody-ER，Ab1）的吸附基底。利用UV、SEM、TEM及細胞毒性測試對材料的理化特性進行表征。Au NCs與MWCNT-NH2復合物具有低毒性、高活性比表面積、良好的生物兼容環(huán)境以及其新穎獨特籠狀結構，能夠有效增強了電極表面的電子轉移能力，且與 Ab1抗體間發(fā)生高強度地形反應，增加了 Ab1在電極表面的固載量,從而能夠將更多的乳腺癌 MCF-7細胞吸

13、附在傳感器上。利用偶聯(lián)劑EDC+NHS的作用將ssDNA的5’端修飾乳腺癌ER蛋白抗體制備ssDNA-Ab2生物探針分子，這種方式既避免了抗體酶標記的過程,又具有較高的捕獲效率。最后通過構建修飾有功能化納米材料-抗體Ab1、乳腺癌MCF-7細胞和ssDNA-Ab2生物探針的三明治型仿生界面成功實現(xiàn)對乳腺癌MCF-7細胞的測定。該免疫傳感器也具有較好重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，同也適用于其他相關的腫瘤標志物。這種構建方式為腫瘤細胞檢測提供了一種有效的