臍帶血來源的iNKT細胞體外培養(yǎng)及其對乳腺癌細胞殺傷作用的研究.pdf

1、乳腺癌是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代開始逐年升高。尤其在發(fā)達國家，目前已上升至女性死亡原因的第一位。目前腫瘤的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等。腫瘤的免疫治療是通過激活人體免疫系統(tǒng)，依靠自身免疫機能殺滅癌細胞，是繼手術(shù)、化療和放療后的一種新的腫瘤治療手段，也是治療乳腺癌尤其是三陰乳腺癌一個極具前景的輔助策略。
　　iNKT細胞是一類既表達T細胞受

2、體又表達NK細胞表面標志的一組異質(zhì)性淋巴細胞亞群，在先天固有性免疫和后天適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用。α-半乳糖神經(jīng)酰胺，是一種強有效的iNKT細胞激活劑，通過CD1d分子提呈和TCR介導(dǎo)的方式激活iNKT細胞，從而刺激iNKT細胞的大量增殖活化?；罨膇NKT細胞，既可直接作為抗腫瘤效應(yīng)細胞發(fā)揮殺傷作用，又能通過激活其他免疫效應(yīng)細胞，間接實現(xiàn)抗腫瘤作用。iNKT細胞療法是一種新的腫瘤免疫治療方法。
　　目的:
　　本研究擬對

3、人臍帶血來源iNKT細胞體外培養(yǎng)進行優(yōu)化，探索高效的體外制備iNKT細胞的方法。觀察GM-CSF聯(lián)合α-GalCer和IL-2體外制備人臍帶血來源iNKT細胞的優(yōu)勢，并觀察其對不同亞型乳腺癌細胞體外的殺傷效果。
　　方法:
　　采用加入GM-CSF聯(lián)合α-GalCer和IL-2的方法體外制備iNKT細胞，與常規(guī)方法（加入α-GalCer和IL-2）進行對比，用只加IL-2作為對照，觀察制備的單個核細胞的增殖情況，采用流式細胞

4、儀檢測單個核細胞中iNKT細胞、NK細胞、T細胞所占的比例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定培養(yǎng)上清中細胞因子IL-4和IFN-γ的濃度，采用CCK-8法檢測對不同亞型乳腺癌細胞株（MDA-MB-231、MCF-7及AU-565）的殺傷效果。
　　結(jié)果:
　　人臍帶血單個核細胞增殖情況:倒置顯微鏡下觀察，3組細胞在第3天左右開始增殖，第7～14天保持較快的增殖速度。統(tǒng)計分析表明，兩實驗組比對照組增殖速度較高，但無統(tǒng)計學

5、差異。
　　單個核細胞中iNKT細胞、NK細胞、T細胞所占比例:第0天，人臍帶血單個核細胞中iNKT細胞所占比率較低，僅加入IL-2后并不能增加iNKT細胞的比率。而兩個實驗組加入α-GalCer及不同細胞因子后均能使iNKT細胞擴增。第7天時，兩個實驗組中iNKT細胞所占比例差異無統(tǒng)計學意義，而第14天時，GM-CSF+α-GalCer+IL-2組的iNKT細胞所占比例明顯增高，與其他組對比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。本培

6、養(yǎng)方法中NK細胞(CD3-CD161+)所占比率，第7天和第14天時，兩個實驗組均低于對照組且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，而兩個實驗組比較，差異無統(tǒng)計學意義。在本研究的培養(yǎng)方法中T細胞(CD3+)所占比率，第7天和第14天時，兩個實驗組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義，兩個實驗組比較，差異也無統(tǒng)計學意義。
　　培養(yǎng)上清液中IL-4、IFN-γ的濃度:第1天時，三組IL-4的濃度均較低，而IFN-γ的濃度兩個實驗組稍高于對照組

7、，但差異均無統(tǒng)計學意義。第7天時，IL-4的濃度實驗組均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，而兩個實驗組對比差異無統(tǒng)計學意義; IFN-γ的濃度實驗組均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。第14天時，IL-4的濃度實驗組均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，而兩個實驗組對比差異無統(tǒng)計學意義; IFN-γ的濃度，實驗組均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，兩個實驗組對比，GM-CSF+α-GalCer+IL

8、-2組明顯高于α-GalCer+IL-2組，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　CCK-8法檢測各組培養(yǎng)細胞對不同亞型乳腺癌細胞株（MDA-MB-231、MCF-7及AU-565）的殺傷作用:兩個實驗組對三種亞型乳腺癌細胞均產(chǎn)生顯著的殺傷效果，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。GM-CSF+α-GalCer+IL-2組與α-GalCer+IL-2組相比，殺傷效果差異不顯著。而對三種乳腺癌細胞株殺傷效果之間比較，差