來源于Yersinia kristensenii的新型植酸酶基因YkAPPAS在畢赤酵母中的表達研究及其酶學(xué)特性分析.pdf

1、通常情況下，糧食中的肌醇和磷大多以植酸的狀態(tài)存在。以植酸鹽狀態(tài)存在的有機磷酸化合物被稱為植酸磷。動物要吸收飼料中以植酸磷狀態(tài)存在的磷，只有將植酸磷催化成無機磷酸鹽的形式。
　　植酸酶屬磷酸單酯水解酶，是最近幾年出現(xiàn)的一種新型綠色添加劑，它通過催化過程，將植酸以及植酸鹽催化成磷酸（或鹽）和肌醇。有很多實驗研究證明，使用植酸酶作為飼料添加劑時，磷的吸收率可被提高，無機磷的補充量被減少，同時動物糞便中無機磷的比重也下降；在飼料中植酸酶的

2、加入能有效的抑制機體內(nèi)的植酸與金屬離子和蛋白質(zhì)生成絡(luò)合物，提高多種微量元素和蛋白質(zhì)的利用率。
　　天然來源的植酸酶普遍存在表達水平低、提取困難、成本高等問題，這些問題都導(dǎo)致其難以滿足現(xiàn)實生產(chǎn)的需要。所以構(gòu)建基因工程菌作為微型生物反應(yīng)器來實現(xiàn)異源高水平分泌表達，成為解決這一問題的關(guān)鍵。通過基因工程手段能夠解決天然植酸酶分泌量低及抗逆性和熱穩(wěn)定性差等問題。利用巴斯德畢赤酵母作為生物反應(yīng)器誘導(dǎo)重組植酸酶表達的方法是最具有優(yōu)勢的，該方法操

3、作簡便、表達量大且適宜工業(yè)化生產(chǎn)。
　　憑借微生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，對植酸酶結(jié)構(gòu)和功能的探索正逐漸的成熟與深化。本文對來源于Yersinia kristensenii的植酸酶基因YkAPPA進行改造，并成功實現(xiàn)了在大腸桿菌（Escherichia coli）EG60和畢赤酵母（Pichia pastoris）GS-115中異源表達，同時對其重組植酸酶相關(guān)酶學(xué)特性和動力學(xué)參數(shù)等進行了研究分析，主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用

4、NCBI數(shù)據(jù)庫公布的來源于Yersinia kristensenii（基因登錄號為JQ394763.1）的植酸酶基因序列，按照畢赤酵母的密碼子偏愛性對目的基因進行優(yōu)化，優(yōu)化前與優(yōu)化后的氨基酸序列完全一致。設(shè)計合成長度為60bp的小片段引物序列，利用 PTDS基因合成技術(shù)合成了新的重組植酸酶基因 YkAPPAS，重組植酸酶基因全長為1266bp，依據(jù)密碼子偏好性將 GC含量調(diào)整至51.9％。本實驗獲得的植酸酶YkAPPAS經(jīng)過對比后發(fā)現(xiàn)，

5、其氨基酸序列中含有植酸酶的最具保守的兩個區(qū)域：分別是與植酸酶底物結(jié)合位點RHG×R×P和酶的催化中心HD。將合成的目的基因與pMD18-T載體連接克隆及測序，隨后將測序成功的目的基因與表達載體相連，合成pYPX88-YkAPPAS載體。利用電擊法將載體導(dǎo)入酵母GS-115中，篩選具有高活性的轉(zhuǎn)化株，用終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵上清液中酶的分泌量可達到106.73μg/mL，完成了重組植酸酶YkAPPAS在畢赤酵母中的高活性、高產(chǎn)量

6、的表達。在重組植酸酶YkAPPAS基因的5’端添加了6個His標記，所以利用硫酸銨分級沉淀法進行蛋白的初步純化后再利用Ni離子親和層析分離出單一的植酸酶重組蛋白。聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果顯示，重組植酸酶YkAPPAS的蛋白分子量約為46kDa，實際結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測理論值一致，說明YkAPPAS幾乎沒有糖基化現(xiàn)象的發(fā)生。
　　2.將純化后的重組植酸酶進行酶學(xué)特性分析，研究結(jié)果顯示，其最適pH分別是pH4.5和pH6，pH3-pH1