生物小分子與DNA相互作用的光譜及二維核磁的研究.pdf

1、癌癥是目前危及人類生命的最主要疾病之一，在當今世界的疾病中，癌癥的致死率要占到25％左右?？茖W家歷經(jīng)數(shù)代人的艱辛努力，正花很大力氣來攻克這個危害人類健康的堡壘。目前治療癌癥普遍使用兩種方法:一種是化學療法;另一種是放射元素治療;簡稱化療和放療。在化療的過程中幾乎所有的抗癌藥物在殺傷癌細胞的同時也殺傷正常細胞。同樣，放療也會因為放射線在治療癌癥的同時給身體帶來一定的傷害。因此，提高抗癌藥物的選擇性、研制開發(fā)高效低毒的抗癌藥物就成為科學家們

2、關(guān)注的焦點。
　　對于治療癌癥我們還有第三種路徑可選擇，那就是從基因水平上治療。分子生物學和分子藥理學的發(fā)展使人們能夠從基因水平理解某些生命現(xiàn)象，并通過分子設(shè)計來尋找靈敏的核酸探針和有效的治療藥物。絕大多數(shù)抗癌劑在生物體內(nèi)的靶點是DNA分子，其作用方式大致分為三種:(1)藥物與模板DNA形成非共價復(fù)合物，主要與DNA以氫鍵相結(jié)合。當雙鏈開始解離時，藥物也隨之從DNA上脫離。(2)藥物與模板DNA形成共價復(fù)合物，主要與DNA以共價鍵

3、相結(jié)合。若介于DNA的雙鏈之間，則在雙鏈之間形成交聯(lián)，從而妨礙DNA雙鏈的拆開。(3)選擇性地與DNA結(jié)合，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，引起單鏈或雙鏈斷裂，降解模板DNA。由此可見，對DNA特定序列的斷裂，應(yīng)是抗癌劑高效殺滅癌細胞又保護正常細胞的主攻方向。
　　人類基因組序列的揭示，為DNA特定序列的斷裂提供了基礎(chǔ)。研究表明，作為基因載體的DNA在聚合酶的錯誤復(fù)制、化學污染的侵襲、藥物的濫用及電磁輻射的損傷下會產(chǎn)生堿基錯配，通常細胞

4、內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)會及時將其修復(fù)，可一旦修復(fù)不成功，堿基錯配將導致子系DNA的誘變，引發(fā)各種分子病，例如癌癥等等。因此，作為分子病檢測診療技術(shù)基礎(chǔ)的DNA錯配識別體系的開發(fā)和研究具有重要意義。由于小分子與核酸的鍵合能力非常強，而體積又小，易通過細胞膜進入細胞內(nèi)部，直接與核酸作用，所以國際上已有很多課題組在研究小分子對核酸的識別，已經(jīng)取得很大進展。核酸識別體系與核酸的作用方式有共價鍵合與非共價鍵合，如抗癌藥物順鉑與核酸的作用為共價鍵合。而非共價

5、鍵合的識別體系又分為兩種，一種稱為溝鍵合劑，其形狀基本與核酸的大小溝互補，靠范德華力或與堿基形成氫鍵，在核酸的大溝或小溝處鍵合，如Distamycin，SN7167以及多胺類化合物;另一種稱為插入劑，通常含有異環(huán)甲面大配體，插入到核酸堿基對間，這種作用使得DNA的構(gòu)型發(fā)生很大變化，如抗癌藥物Nogalamycin（諾加霉素）以及本課題組和計亮年院士課題組一直研究的惰性金屬多吡啶類混配配合物。美國的Barton教授課題組曾合成了一種銠的配

6、合物[Rh(bpy)2(chrysi)]3+，該配合物以插入方式與DNA鍵合，對單堿基C∶C錯配具有特異選擇性。伯明翰大學Hannon教授課題組又發(fā)現(xiàn)了一種新的藥物-核酸作用模式，即藥物在“三向連接DNA（3-way DNA junction）”的中心處鍵合，該工作已在Angewandte Chemie(2006 volume45 issue8 pages1227-31)上發(fā)表。著名的生物化學家Stephen Neidle多年來一直致力

7、于研究小分子對核酸的識別及抗癌藥物的設(shè)計，在其新著的《Nucleic Acid Structure and Recognition》中也詳細介紹了小分子對核酸的識別。我們課題組在研究中也發(fā)現(xiàn)了許多更有意義的切入點。特別值得提出的是，在所有的堿基錯配中，剪式G∶A錯配構(gòu)型多樣，是最難識別和修復(fù)的，已有的研究結(jié)果表明，含剪式G∶A錯配的DNA比正常的B型DNA有較寬的小溝，而且核苷酸A從鏈內(nèi)滑移出來，與互補鏈的核苷酸A形成交聯(lián)堆積。因此本論

8、文著重于設(shè)計合成并篩選出幾種對G∶A錯配具有特異選擇性的識別體系，并研究它們與這類寡聚核苷酸的精細、確切的作用情態(tài)。為分子病的檢測提供某些實驗和理論依據(jù);
　　由于不同的錯配對應(yīng)于不同的錯配識別體系。DNA錯配識別體系大都是一些含有芳香大環(huán)配體的手性金屬配合物。其相互作用有不少的難點:其一，盡管核酸構(gòu)型的多樣性已逐漸被人們認識，但由于研究方法的局限性，目前對這一領(lǐng)域的認識還不完善、不系統(tǒng)、甚至不同的研究方法得出的結(jié)果也不同，因而對

9、它們的識別研究是十分復(fù)雜的;其二，由于體系的相互作用是在溶液中的動態(tài)過程，通常是用光譜法研究它們與DNA或寡聚核苷酸的作用，而這種研究得出的直接信號是光譜的紅移紫移、增色減色，得到的是一些現(xiàn)象學的間接結(jié)果，很難確證;鑒于以上兩個原因，我們利用二維核磁的NOESY、TOCSY等圖譜對它們的作用進行了研究。同時利用分子模擬，研究了構(gòu)成識別體系的金屬配合物與DNA相互作用的精細情態(tài)和規(guī)律，并揭示金屬配合物與核苷酸相互作用的規(guī)律。我們設(shè)計了兩處

10、含G∶A錯配的十聚錯配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)2和正常的寡聚核苷酸d(CCTAATTAGG)2，并合成了三種金屬配合物[Co(phen)2(DPQ)]Cl3;[Co(phen)2(HPIP)]Cl3;[Co(phen)2(HNAIP)]Cl3，然后用這三種金屬配合物與正常d(CCTAATTAGG)2及錯配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)2的作用相對照，得出較滿意的結(jié)果。同時我們還發(fā)現(xiàn)了一些小分子體系能夠切割PBR322D

11、NA，一些金屬配合物能夠?qū)ξ赴┘毎甑幕钚跃哂泻芎玫囊种菩Ч?br>　　基于以上的工作，我們概括如下:
　　1.我們首次發(fā)現(xiàn)6-芐氨基嘌呤可與Co2+、Ni2+形成穩(wěn)定配合物，它們的存在影響藥物分子與DNA之間的相互作用，本文從吸收光譜、熒光光譜、Scatchard圖等方面研究了6-芐氨基嘌呤及其金屬配合物與小牛胸腺DNA之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)這些金屬配合物與DNA都存在靜電結(jié)合。同時，我們發(fā)現(xiàn)8-氮雜腺嘌呤可與Co2+、Cu2+

12、形成穩(wěn)定配合物，用同樣方法我們發(fā)現(xiàn)，這些8-氮雜腺嘌呤的金屬配合物與DNA都存在嵌插結(jié)合。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)存的廣譜抗癌藥物（治療L1210、P388白血病，肉瘤SA180，淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌，黑色素瘤B16，乳腺癌，路易斯肺癌以及結(jié)腸癌38等）——表柔比星可與Cu2+形成2∶5的穩(wěn)定體系，并且通過紫外光譜、熒光光譜、粘度實驗、DNA熔點實驗、電化學實驗以及切割實驗發(fā)現(xiàn)表柔比星及表柔比星-Cu2+體系與DNA之間的作用

13、均為嵌插作用，同時表柔比星-Cu2+體系能在1.0×10-5mol·L-1濃度下將pBR322DNA切割出明顯的線性。
　　3.我們首次合成了二水楊醛三乙基四胺合鎂(Ⅱ)配合物并應(yīng)用紫外光譜、熒光光譜、粘度實驗、DNA熔點實驗、電化學實驗以及切割實驗對其與DNA的相互作用進行了研究。結(jié)果表明，該配合物與EB在DNA上的結(jié)合位點是非競爭型的，同時發(fā)現(xiàn)該配合物能在較低濃度(10-6mol/L)下斷裂pBR322質(zhì)粒DNA，當配合物濃度

14、達10×10-5 mol·L-1時，可將pBR322質(zhì)粒DNA切割為線性(formⅢ，linear帶)，說明該配合物具有較高的切割質(zhì)粒DNA的活性。而且我們推測，二水楊醛三乙基四胺合鎂(Ⅱ)配合物對質(zhì)粒DNA的作用很可能是水解切割，即其能較快地推動pBR322DNA磷酸二酯鍵的水解。這一結(jié)果為開發(fā)新的人工核酸酶、從分子水平上探討配合物在藥物的開發(fā)和分子生物學中的應(yīng)用提供了有價值的信息。
　　4.我們合成了[Ru(phen)2tpp

15、hz](PF6)2·2H2O及[Co(phen)2tpphz]Cl(PF6)2·2H2O兩種配合物，并通過切割實驗及細胞毒性實驗首次發(fā)現(xiàn)[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O及[Co(phen)2tpphz]Cl(PF6)2·2H2O均可導致胃癌細胞活性不同程度的降低，1nM[Co(phen)2tpphz]Cl(PF6)2·2H2O可以使胃癌細胞株7901成活率降低22.2％;1μM[Co(phen)2tpphz]Cl(

16、PF6)2·2H2O可以使胃癌細胞株7901成活率降低30.6％。1nM[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O可以使胃癌細胞株7901成活率降低25.2％;1μM[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O可以使胃癌細胞株7901成活率降低48.6％。這一結(jié)果說明所合成的[Co(phen)2tpphz] Cl(PF6)2·2H2O及[Ru(phen)2tpphz](PF6)2·2H2O配合物對癌細胞有很好的抑制

17、作用。電泳實驗表明它們均能在很低的濃度(5×10-6 mol·L-1)將pBR322 DNA切割為線性。
　　5.我們利用二維核磁研究了三種金屬配合物[Co(phen)2(HPIP)]Cl3;[Co(phen)2(HNAIP)]Cl3;[Co(phen)2(DPQ)]Cl3分別與錯配d(CCGAATGAGG)2及正常d(CCTAATTAGG)2的十聚寡聚核苷酸的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　對于配合物[Co(phen)2(HPIP)

18、]Cl3，在其與錯配寡聚核苷酸作用的NOESY譜上，我們看出，由于NOE相關(guān)峰主要來自于錯配G∶A附近區(qū)域的大溝質(zhì)子，例如相關(guān)峰T6H6/A5H2'的消失，相關(guān)峰A8H8/G7H4'的減小，都說明[Co(phen)2(HPIP)]3+從“大溝”插入到錯配G∶A附近的堿基對，從而影響到附近堿基對的相關(guān)峰，近一步的指認我們可以確定[Co(phen)2(HPIP)]3+插入到堿基對T6G7之間。[Co(phen)2(HPIP)]3+與正常寡聚

19、核苷酸作用的NOESY譜上，我們看出，[Co(phen)2(HPIP)]3+從小溝與正常寡聚核苷酸的端基作用。31P NMR表明配合物的加入沒有改變正常寡聚d(CCTAATTAGG)2的磷酸骨架。由分子模擬可以得知配合物[Co(phen)2HPIP]3+對正常及剪式錯配DNA都具有識別作用，識別的過程體現(xiàn)了異構(gòu)體的選擇性、DNA溝的選擇性和位點特異性，在識別錯配序列DNA的過程中手性選擇性不明顯，優(yōu)先選擇配合物結(jié)構(gòu)形式Ⅱ與DNA在T6G

20、7大溝發(fā)生作用;與正常DNA的相互作用優(yōu)先選擇配合物結(jié)構(gòu)形式Ⅰ，在小溝端基發(fā)生作用，同時右手異構(gòu)體會被富集。以上這些結(jié)果表明，分子模擬能夠與二維核磁實驗很好的吻和。
　　對于[Co(phen)2(DPQ)]Cl3，在NOESY譜上，我們可以看到許多[Co(phen)2(DPQ)] Cl3與錯配及正常寡聚核苷酸作用的NOE相關(guān)峰。對于錯配寡聚核苷酸，NOE相關(guān)峰主要來自于端基G∶C質(zhì)子，我們判定配合物[Co(phen)2(DPQ)]

21、3+主要從小溝與G∶C區(qū)域作用，并且插入不深。對于正常寡聚核苷酸，數(shù)據(jù)表明[Co(phen)2(DPQ)]3+從小溝插入到堿基對T3/A4間。由于核苷酸G4和A5糖環(huán)上H4'與H5'/H5"共振的重疊，不可能清晰地歸屬為哪個核苷酸，但是出現(xiàn)的NOE相關(guān)峰表明配合物確實是插入鍵合。與這一插入模型相一致的是DPQ與大溝質(zhì)子T3CH3的NOE相關(guān)峰，表明DPQ體系從小溝橫跨堆積的堿基對而延伸到大溝里。31PNMR表明配合物的加入沒有使得DNA

22、的構(gòu)型發(fā)生顯著的改變。分子模擬結(jié)果顯示[Co(phen)2(DPQ)]3+與錯配寡聚DNA d(CCGAATGAGG)2作用時，作用在小溝，端基，同時左手異構(gòu)體與錯配寡聚的作用更加穩(wěn)定，能量更低，左手異構(gòu)體會被富集;與正常d(CCTAATTAGG)2寡聚核苷酸作用在小溝的T3A4區(qū)作用，同樣左手異構(gòu)體會被富集。這些結(jié)果與實驗結(jié)果非常一致。
　　對于[Co(phen)2(HNAIP)]3+，在其與錯配寡聚核苷酸作用的NOESY譜上，