NMR方法對蛋白復合物結構的研究.pdf

1、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)方法是分子結構分析中不可或缺的研究手段，與X射線晶體衍射構成生物大分子三維空間結構測定的兩大互補方法。隨著生命科學的飛速發(fā)展，在基因組基礎上研究蛋白質結構、功能，尤其是其相互作用網絡，已成為后基因組時代生命科學新的前沿。分子水平蛋白質相互作用的研究對于理解許多生物學過程至關重要，在應用方面對于人類疾病分子機理的理解和藥物設計有著重要的指導意義和經濟價值，核磁共振方法

2、在研究這類溶液狀態(tài)下原子水平的蛋白質和其他分子相互作用及不同強度和不同時間尺度的動力學方面有著其顯著的優(yōu)勢。 本論文工作的重點是用異核多維核磁共振方法測定蛋白質-小肽配體復合物結構。我們表達純化了人AF-6蛋白，通過NMR方法測定了AF-6蛋白PDZ結構域與Bcr蛋白C-末端小肽復合物的溶液結構，并在此基礎上對兩者相互作用的方式進行了探討。我們還通過主鏈動力學研究發(fā)現AF-6 PDZ在配體結合前后ms-μS)艮度上并無明顯變化，

3、根據相關時間推測AF-6 PDZ具有一定的二聚傾向，但并不影響結構解析。此外，我們還克隆表達純化了人SUMO-2和SUMO-3全長蛋白，以及SUMO共價修飾體系中的酶E1(SAE1/2)和E2(Ubc9)，研究了它們之間的相互作用，并嘗試搭建體外共價修飾系統以獲得共價修飾的復合物從而進行核磁結構解析。論文分為以下三個部分： 第一章綜述了各種用于研究蛋白質復合物結構的核磁共振方法，其中很多技術也適用于其他系統，如蛋白質-核酸、蛋白

4、-糖、蛋白-脂、蛋白-藥物復合物。這些技術的選擇取決于以下因素：分子的大小和類型；結合平衡常數(緊結合或弱結合)；結合動力學(快交換或慢交換)；化學計量和對稱性。對于不同的情況，采用不同的策略及實驗方法。此部分首先介紹了研究復合物前對樣品條件的優(yōu)化方法；描述了在復合物的整體結構不能或不太容易確定的情況下對相互作用界面的界定；接著介紹了復合物譜峰認證的實驗方法，這與標記單個蛋白質的譜峰認證完全相同；列舉了X-filter NMR．實驗的不

5、同類型，X-filter實驗被廣泛應用于選擇性區(qū)分分子間或分子內的結構信息；最后介紹了如何運用這些信息進行結構計算。 第二章是人AF-6蛋白PDZ結構域與Bcr蛋白C-末端小肽復合物的溶液結構及其動力學研究。首先對本工作的研究背景，即AF-6蛋白及PDZ結構域的功能和結構、Bcr蛋白的功能和結構進行了全面的介紹。AF-6基因最早是在急性淋巴性白血病人中作為ALL-1的融合配體被發(fā)現的。隨后的研究表明AF-6是信號蛋白Ras和Ra

6、pl的效應蛋白，在細胞連接和信號轉導中起著重要作用。AF-6可以通過其C-末端的PDZ結構域結合Bcr，而通過其N-末端的RBD結構域結合Ras，從而形成一個三元復合物，調控細胞一細胞連接處Ras介導的信號轉導途徑。在正常細胞中，Bcr可以磷酸化AF-6，使得AF-6通過其PDZ結構域與Bcr。中的C-末端部分結合，此相互作用可以提高AF-6 RBD結構域對Ras的親和性，通過競爭使Ras不再與Raf結合，從而下調Raf/MEK/ERK

7、信號轉導途徑，使蛋白激酶級聯反應失活。通過異核多維核磁共振的方法，我們獲得了AF-6蛋白PDZ結構域與Bcr C-末端小肽(KRQSILFSTEV)復合物的高分辨率三維溶液結構，并對每個殘基在結合過程中的作用方式進行了討論。PDZ結構域結合前后結構變化不大，由六段p折疊和兩段α螺旋組成，Bcr小肽位于PDZ結構域的αB和βB形成的疏水溝槽中，與βB形成反平行的β折疊。一般認為PDZ結構域與配基相互作用的特異性是由配體0位和-2位的殘基所

8、決定。與典型的第一類PDZ和第二類PDZ不同的是，AF-6 PDZ結構域αB：1位的殘基是G1n70，與小肽-2位Thr通過范德華力作用，形成了一種非典型的結合模式。此外我們的結果表明Bcr C-末端五個殘基在與AF-6 FDZ結構域的相互作用中都有貢獻，而βB/βC的loop區(qū)不參與結合。我們對AF-6 PDZ的分類進行了詳細的討論，發(fā)現不論是基于配體序列還是基于PDZ序列，現有的分類方法都無法適用于AF-6 PDZ，從而需要人們對P

9、DZ分類及現有機理進行更深入的研究。 通過核磁馳豫研究，我們對結合前后的主鏈動力學進行了比較，推測AF-6 PDZ結構域存在單體一二體平衡，但通過NMR化學位移實驗證實二聚對結構沒有影響。我們的工作不僅對AF-6 PDz結構域與Bcr小肽結合的相互作用模式進行了深入的研究，也為PDZ分類學的發(fā)展和藥物設計提供了分子基礎。 第三章簡要介紹了對泛素類相關修飾蛋白質SUMO及其與酶體系相互作用的研究。SUMO是一類廣泛存在，在

10、所有真核生物中高度保守的蛋白質家族。蛋白質翻譯后被SUMO修飾這一過程，稱之為SUO化，是一種重要的細胞內調控機制。細胞內蛋白質的SUMO化是涉及多個酶的多步調控的級聯反應，需要活化酶E1、綴合酶E2，在多數情況下還需要連接酶E3，再加上SUMO和底物，通過順序的酶促反應，最后SUMO羧基末端的Gly經異肽鍵共價連接到底物蛋白的Lys側鏈ε-NH<,2>上，這個Lys通常位于底物蛋白保守的ΨKXE基序上(其中Ψ是疏水殘基，X是任意殘基)

11、。同泛素化主要介導蛋白質進入蛋白質酶體降解不同，SUMO化在細胞內有著多方面重要的生理功能：核內外物質的運輸、蛋白質定位、轉錄活性調控、拮抗泛素化、細胞周期行進、維持基因組的完整性等。目前的研究表明人的SUMO家族各個成員在細胞內的定位和功能既有交疊又有不同。由于SUMO-1被廣泛研究，而SUMO-2/3報道不多，我們的工作重點放在對SUMO-2/3及其酶體系的相互作用研究上。 首先我們成功克隆、表達、純化了帶有C末端雙Gly活

12、性位點的人SUMO-2/3全長蛋白，為了防止SLIMO-2/3自身的多聚，我們突變了K11位點。然后利用MS、FPLC、CIEF等方法對蛋白的穩(wěn)定性和均一性做了研究，核磁結果顯示各個錢基交叉峰的信號強度差異很大，表明蛋白有一定的聚合，無法進行后續(xù)的譜峰歸屬。此外我們用Ubc9小肽滴定SUMO-2/3，HSQC譜峰的化學位移沒有任何變化，說明僅僅包含有α1的Ubc9肽段不足以與SUMO-2/3 K11R結合，空間上其他位點可能也參與了它們