地衣芽胞桿菌遺傳改良及在淀粉脫支酶表達中的應(yīng)用.pdf

1、脫支酶是淀粉酶系中重要的酶品，為淀粉徹底水解所必需。目前為止能夠高效專一水解淀粉分子中α-1，6糖苷鍵的脫支酶主要有兩種:普魯蘭酶和異淀粉酶。本課題組前期研究中建立了較為完善的地衣芽胞桿菌表達系統(tǒng)，并已成功應(yīng)用于α-淀粉酶、β-淀粉酶的高效表達，為此，本研究嘗試了其對普魯蘭酶和異淀粉酶的異源表達，主要內(nèi)容如下:
　　以地衣芽胞桿菌Z902(Δamy)表達系統(tǒng)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了堿性蛋白酶基因缺失的突變菌株Z113，后者胞外蛋白酶活力為前

2、者的21％，明顯減少了蛋白酶的分泌，同時堿性蛋白酶基因的缺失對菌體的正常生長影響甚微。
　　普魯蘭酶和異淀粉酶在地衣芽胞桿菌中的游離表達:將含有普魯蘭酶基因的表達載體pBE-pulB，電轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌Z902和Z113，進行搖瓶發(fā)酵，對比兩種重組菌的產(chǎn)酶特征。結(jié)果表明，重組菌Z902/pulB的發(fā)酵液里沒有檢測到酶活力，而Z113/pulB的酶活力達41 U/mL，是本實驗室前期研究中最高產(chǎn)酶水平的2倍，普魯蘭酶表達水平得到進

3、一步提高，同時表明堿性蛋白酶基因刪除的必要性。
　　通過PCR擴增異淀粉酶編碼基因iso并克隆入表達載體pHY-WZX，在枯草桿菌1A717中獲得重組質(zhì)粒，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入Z902、Z113中，搖瓶發(fā)酵Z902/ISO酶活力達330 U/mL，而Z113/ISO酶活力達425 U/mL，實現(xiàn)了異淀粉酶的高效表達。Z113/ISO基本酶學(xué)特征分析表明:該重組酶適宜反應(yīng)條件為50-55℃，pH6.5-9.0; K+、Ca2+

4、、Mg2+離子對其有促進作用，其它離子或化合物強烈抑制其酶活;底物特異性為:支鏈淀粉＞糖原＞糯米淀粉＞普魯蘭糖。
　　進一步分析了普魯蘭酶和異淀粉酶在水解糊精制備麥芽糖漿中作用，結(jié)果，與單獨使用β-淀粉酶相比，這兩種脫支酶分別和β-淀粉酶復(fù)配使用都能夠顯著提高麥芽糖的生成率，分別達78.61％和76.35％，但異淀粉酶與普魯蘭酶相比，生成的麥芽糖純度更高，更有助于高純度麥芽糖漿的制備。
　　由于游離表達畢竟存在其遺傳不穩(wěn)定性