鹽角草銅鋅超氧化物歧化酶基因(SeCZS)的克隆和耐鹽性分析.pdf

1、世界上土地資源正日益遭受著干旱、風化、土壤鹽堿化等的多種脅迫。我國分布有廣泛的鹽堿地,面積約有0.33億hm2,還在逐步擴大,鹽脅問題越來越嚴重。土壤中的鹽濃度高,對許多的植物造成了不可逆的傷害,抑制植物的生長,甚至造成植物死亡。世界各國在控制和改良鹽堿地方面,主要通過灌溉農業(yè)、物理化學及生物技術等措施。目前,通過研究植物的耐鹽機制,利用生物技術方法克隆耐鹽植物的耐鹽基因,培育抗鹽作物品種,可以有效地解決土壤鹽堿化帶來的不利影響。鹽角草

2、是鹽角草屬一年生低矮草本植物,生于平原荒漠區(qū)湖邊潮濕鹽土上。它們是典型的耐鹽植物,耐鹽機制受到越來越多的研究者關注。超氧化物歧化酶(SOD)是機體內可以催化超氧陰離子生成O2和H2O2的金屬酶,在生物體內廣泛存在,而且可以迅速的清除活性氧。研究發(fā)現(xiàn),SOD在醫(yī)學、食品保健和化妝品方面都起到重要的作用,應用廣泛。SOD可以起到防御損傷的作用,與多種疾病有關,它們與植物的抗逆性方面也是密切相關的。
　　本實驗選取的耐鹽植物為鹽角草,用

3、RACE的方法克隆出鹽角草Cu/Zn-SOD基因,使用生物學軟件分析核苷酸和氨基酸序列,并進行同源性比對。構建原核表達載體,轉化大腸桿菌,使目的蛋白在重組菌中表達,并分析了不同鹽濃度并含有抗生素的液體LB培養(yǎng)基中菌的生長情況,IPTG誘導表達,通過測定波長為600的OD值來分析Cu/Zn-SOD基因的耐鹽功能。為以后研究鹽角草Cu/Zn-SOD基因的應用以及在植物抗逆性作用中的應用奠定基礎,如培育耐鹽農作物新品種。
　　1.通過簡

4、并引物PCR擴增和RACE技術,克隆出鹽角草Cu/Zn-SOD基因。鹽角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank登錄號:JQ074238.2)全長為660bp,開放閱讀框長為459bp,推測編碼152個氨基酸,蛋白分子量約為15.1KDa,其氨基酸序列與堿蓬的序列相似性為96％,與黃燈籠辣椒的序列相似性為88%。生物學軟件分析表明Cu/Zn-SOD蛋白可能存在于細胞質。
　　2.根據獲得的鹽角草Cu/Zn-SOD基因序列設計引物,

5、擴增編碼區(qū),并在引物序列上分別加入NotI和BamHI酶切位點。構建原核表達載體pET-Cu/Zn-SOD和對照pETDuet-1,轉化大腸桿菌E.coliBL21中。蛋白經IPTG誘導表達。經SDS-PAGE蛋白電泳檢測發(fā)現(xiàn)表達蛋白條帶大小與預期一致,說明目的蛋白成功表達。
　　3.將重組菌接種到含鹽濃度為1%、5%、6%、7%的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),10h后每3h,測定一次OD600值。結果發(fā)現(xiàn)重組表達菌BL21(pET-Cu