ING4通過逆轉(zhuǎn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲.pdf

1、目的：探討慢病毒介導(dǎo)的生長抑制因子ING4過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　?。?）以攜帶人源化ING4編碼序列（CDS）的pAdTrack-CMV/ING4質(zhì)粒為模板，利用ING4特異性引物（ING4-F：5'-gaa gct agc gcc acc atg gct gct ggg atg tat ttg-3'；ING4-R：5'-ata ggc gcg ccc tat ttc ttc ttc c

2、gt tct tg-3'）
　　通過PCR擴(kuò)增獲得ING4 CDS片段。
　?。?）在GFP標(biāo)記的pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒質(zhì)粒的NheI和SgsI限制性酶切位點之間插入ING4目的片段構(gòu)建ING4重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6.3/ING4/IRES/GFP，并通過PCR、雙酶切、DNA測序鑒定。
　　（3）用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將構(gòu)建正確的pLenti6.3/ING4/IRES/G

3、FP及其對照pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒質(zhì)粒分別與輔助包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、VSVG共轉(zhuǎn)染293T人胚腎細(xì)胞包裝GFP標(biāo)記的ING4重組慢病毒（LV-ING4）及其對照空病毒（LV），并將慢病毒培養(yǎng)上清高速離心濃縮后，用有限稀釋法根據(jù)GFP的表達(dá)進(jìn)行滴度測定。
　　（4）LV-ING4、LV分別用10MOI的最佳感染劑量感染MDA-MB-468三陰性乳腺癌細(xì)胞，通過10μg/ml的滅瘟素（BSD）篩選后獲得MD

4、A-MB-468-LV-ING4（簡寫為MDA-MB-468-ING4）、MDA-MB-468-LV（簡寫為MDA-MB-468-Mock）。熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測GFP分析轉(zhuǎn)基因效率，及RT-PCR、Western blot檢測慢病毒介導(dǎo)ING4在MDA-MB-468細(xì)胞中的表達(dá)。
　　(5)采用Transwell遷移、侵襲實驗檢測MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，分析

5、慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達(dá)對MDA-MB-468三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用。
　　(6)利用Western blot檢測MDA-MB-468-ING4、MDA-MB-468-Mock乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2、Twist1、Twist2）的表達(dá)，分析慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達(dá)抑制MDA-MB-468三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移

6、、侵襲的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。?）成功制備了表達(dá)人源化ING4的GFP標(biāo)記重組慢病毒（LV-ING4）。
　?。?）成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的ING4轉(zhuǎn)基因MDA-MB-468三陰性乳腺癌細(xì)胞。
　?。?）慢病毒介導(dǎo)的ING4過表達(dá)能夠明顯抑制MDA-MB-468三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，MDA-MB-468-ING4較MDA-MB-468-Mock的相對遷移、侵襲力分別為45.7％、36.8%。