Myxococcus xanthus DK1622中NA+-H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

作為主要的鈉離子(Na+)外排系統(tǒng)，鈉離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運蛋白(Na+/H+antiporters，NHAs)也是細(xì)菌中對Na+脅迫適應(yīng)性應(yīng)答的主要系統(tǒng)。NHAs是一種次級鈉泵系統(tǒng)，于1974年在大腸桿菌中首次報道，廣泛分布于細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、植物、動物、哺乳動物乃至人類細(xì)胞內(nèi)。NHAs位于細(xì)胞質(zhì)膜上，是一種跨膜蛋白，它可以利用初級質(zhì)子泵，如ATPase(F0F1)和呼吸鏈產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子電化學(xué)梯度為動力，向膜外轉(zhuǎn)運Na+，同時將H+轉(zhuǎn)運回膜內(nèi)，從而維持胞內(nèi)相對較低的Na+濃度。
　　 目前結(jié)構(gòu)和功能研究最為深入的NHAs是大腸桿菌Ec-NhaA，也是大腸桿菌等腸道細(xì)菌針對Na+及Na+存在條件下堿性pH產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答的主要系統(tǒng)。NhaA蛋白家族存在于許多細(xì)菌和古細(xì)菌中，其主要特點是活性具有高度pH依賴性。Ec-nhaA基因的轉(zhuǎn)錄受其下游基因Ec-nhaR的調(diào)控，后者屬于LysR蛋白家族。Ec-NhaR能與Ec-nhaA基因的上游DNA序列結(jié)合，從而抑制Ec-nhaA基因的轉(zhuǎn)錄。但當(dāng)Na+存在時，與Na+結(jié)合的Ec-NhaR發(fā)生了蛋白構(gòu)象的改變，影響了Ec-NhaR與兩個關(guān)鍵位點G-60和G-92的結(jié)合，從而促進Ec-nhaA基因的轉(zhuǎn)錄。因此，Ec-NhaR既是Na+信號的感受器，又是Na+信號的傳導(dǎo)器，從而高效地調(diào)控Ec-nhaA基因的表達(dá)。
　　 粘細(xì)菌(Myxobacteria)是一類革蘭氏陰性滑動細(xì)菌，具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為，如生長的細(xì)胞密度依賴性，群體捕食，子實體發(fā)育以及在不良環(huán)境中分化形成粘孢子。課題組前期在Myxococcus xanthus DK1622的基因組中發(fā)現(xiàn)了2個預(yù)測為Na+/H+ antiporter NhaA的基因MXAN_3898和MXAN_6055，它們的敲除導(dǎo)致突變株在Na+條件下的生長顯著下降，提示其可能在該菌株的鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用。本論文在此基礎(chǔ)上，深入研究了MXAN_6055基因產(chǎn)物可能的NhaA活性，并且對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了初步探索。
　　 首先圍繞上述基因構(gòu)建了一系列突變體，通過對其在鹽脅迫條件下的生長、運動、發(fā)育等性質(zhì)的分析，證明了MXAN_6055基因確實在M.xanthus DK1622的鹽脅迫應(yīng)答生長中發(fā)揮作用。MXAN_6055敲除突變株YL1012在NaCl或LiCl脅迫下的生長顯著降低，如在200 mM NaCl脅迫下的生長較野生株下降了51％;當(dāng)將該基因再回補到Y(jié)L1012中時，其生長缺陷得到了恢復(fù)，從而證實上述M.xanthus突變株在NaCl或LiCl脅迫下的生長缺陷是由MXAN6055基因引起的。但是，MXAN_6055基因的過表達(dá)并沒有導(dǎo)致菌株耐鹽生長的顯著提高，暗示MXAN_6055基因在細(xì)胞內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制或者更高水平的調(diào)控機制。
　　 其次，利用大腸桿菌Na+/H+ antiporters缺陷菌株KNabc進一步鑒定了MXAN_6055基因產(chǎn)物的NhaA活性。將MXAN_6055基因異源表達(dá)到KNabc菌株中，可使其在堿性條件下(pH7.0-8.0)的Na+和Li+耐受能力從完全敏感分別提高到600mM和100mM。利用高壓破碎法制備了上述菌株的反轉(zhuǎn)膜泡(evertedmembrane vesicles，EM Vs)，并利用吖啶橙熒光淬滅-恢復(fù)實驗檢測了其Na+(Li+)逆轉(zhuǎn)運活性。結(jié)果表明EMVs在pH7.0和8.0時均具有Na+轉(zhuǎn)運活性，且在pH7.0時的轉(zhuǎn)運活性高于pH8.0時。以上結(jié)果證明了MXAN_6055蛋白確實具有Na+(Li+)耐受性和NhaA活性。
　　 最后，對MXAN_6055基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了研究。以E.coli中Ec-NhaA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NhaR為提問序列，通過同源性檢索在M.xanthus DK1622基因組中檢索到其可能的同源基因MXAN_0784，兩者的氨基酸序列一致性為34％。通過突變體構(gòu)建及性質(zhì)分析表明，與野生菌株M.xanthusDK1622相比，MXAN_0784的敲除導(dǎo)致突變株Na+脅迫下生長能力的降低，而其過表達(dá)則導(dǎo)致相應(yīng)條件下生長能力的提高;qRT-PCR的檢測結(jié)果與突變體性質(zhì)分析結(jié)果一致，即:MXAN_0784敲除突變株中MXAN_6055基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，而其過表達(dá)突變株中MXAN_6055基因的表達(dá)水平顯著提高，表明MXAN_0784基因?qū)XAN_6055基因的轉(zhuǎn)錄具有正調(diào)控作用。將MXAN_0784進行異源表達(dá)并純化后，利用bandshift試驗驗證了其與MXAN_6055基因上游調(diào)控序列的特異性結(jié)合能力。以上結(jié)果證明了MXAN_0784作為MXAN_6055基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控了后者在粘球菌鹽脅迫應(yīng)答中的NhaA活性。