DATS逆轉(zhuǎn)K562-A02細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 急性白血病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的血液腫瘤。惡性腫瘤表現(xiàn)出來(lái)的耐藥性一直是治療失敗的主要原因。其中P-gp介導(dǎo)的MDR是腫瘤耐藥性的主要機(jī)制。逆轉(zhuǎn)MDR可以使化療失敗的機(jī)率下降，具有很高的臨床價(jià)值，已成為目前國(guó)內(nèi)外化療藥物研究的重要方向之一。已發(fā)現(xiàn)的多種逆轉(zhuǎn)劑缺乏腫瘤細(xì)胞識(shí)別特異性，會(huì)導(dǎo)致化療藥物藥動(dòng)學(xué)發(fā)生改變，增加毒性，如藥物清除率下降、半衰期延長(zhǎng)、血液濃度增高、分配體積增加等，這些都會(huì)增加對(duì)正常組織的毒性。

2、植物來(lái)源的藥物資源豐富，作用靶點(diǎn)多，具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，顯示其在逆轉(zhuǎn)MDR方面有較好的應(yīng)用前景。本研究應(yīng)用大蒜素提取物DATS處理K562/A02細(xì)胞，觀察其對(duì)阿霉素的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，評(píng)價(jià)DATS與小劑量維拉帕米合用逆轉(zhuǎn)耐藥的效果極其毒性作用，并就其逆轉(zhuǎn)作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 1.甲基四唑藍(lán)(MTT)法增殖抑制實(shí)驗(yàn)1.1測(cè)定DATS和VRP對(duì)細(xì)胞的毒性作用，藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)=(

3、1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100％，根據(jù)線(xiàn)性回歸方程求得10％的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制所需藥物濃度(IC10)。選取DATS和VRP分別低于各自IC10的一個(gè)濃度，作為下述實(shí)驗(yàn)所需安全濃度，并測(cè)定二者以此濃度聯(lián)合應(yīng)用對(duì)K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。
　　 1.2測(cè)定不同劑量的DATS聯(lián)合阿霉素(ADM)對(duì)K562/A02細(xì)胞抑制率的量效和時(shí)效關(guān)系對(duì)照組加入終濃度為5ug/ml的ADM，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5ug/ml的ADM和不

4、同濃度的DATS，培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，上酶標(biāo)儀測(cè)定A值。計(jì)算不同作用時(shí)間不同劑量的DATS和ADM聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
　　 1.3測(cè)定逆轉(zhuǎn)劑對(duì)細(xì)胞藥物敏感性的影響：
　　 加入不同濃度ADM培養(yǎng)48小時(shí)后，計(jì)算阿霉素對(duì)對(duì)照組和各加藥組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。耐藥倍數(shù)=耐藥株IC50/敏感株IC50：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥株IC50/加逆轉(zhuǎn)劑后IC50。
　　 2.光鏡下細(xì)胞形態(tài)的改變?nèi)?duì)數(shù)生長(zhǎng)期

5、的K562/A02細(xì)胞制成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先鋪置無(wú)菌蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組為：
　　 ①K562/A02，②K562/A02+ADM③ K562/A02+DATS+ADM②、③組內(nèi)均加入終濃度ADM1μg/mL，③組加入IC10濃度的DATS。在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后，用HE法染色，光鏡下觀察，拍照。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

6、的K562和K562/A02細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：
　　 ①K562
　　 ②K562/A02③K562+ADM④K562/A02+ADM⑤K562/A02+DATS+ADM⑥K562/A02+VRP+ADM⑦K562/A02+DATS+VRP+ADM以⑥組作為陽(yáng)性對(duì)照，以④組作為陰性對(duì)照。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。調(diào)整各組細(xì)胞濃度為1×105/mL，分別加入DATS或VRP培養(yǎng)48h后，③-⑦加入終濃度為5μ

7、g/mL的ADM，再共同培養(yǎng)2小時(shí)利用ADM自身熒光的特性，經(jīng)FCM檢測(cè)對(duì)照組和各加藥組細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜P-gp取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562和K562/A02細(xì)胞，使其濃度為1×105/mL，分為①K562組②K562/A02組⑧K562/A02+DATS組④K562/A02+VRP組⑤K562/A02+DATS+VRP組每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。對(duì)照組和各加藥組細(xì)胞

8、在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人P-gp單抗P-gp-PE和同型對(duì)照IgG2a-PE6μl，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜P-gp。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/A02細(xì)胞，使其濃度為1×105/mL，接種于50ml培養(yǎng)瓶中。分組：
　　 ①K562/A02組②K562/A02+DATS組③K562/A02+VRP組④K562/A02+DATS+VRP組

9、每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。對(duì)照組和各加藥組細(xì)胞在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。加5μl Annexin V/FITC和10μl(20μg/ml)的PI溶液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ACS軟件分析數(shù)據(jù)。右下象限是Annexin V+PI-細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。
　　 6.RT-PCR檢測(cè)基因的改變?nèi)?duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/A02細(xì)胞，分別用含10％滅活新生牛血清的RPMI-1640稀釋成1

10、×105/mL，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分為①K562組②K562/A02組③K562/A02+DATS組④K562/A02+VRP組⑤K562/A02+DATS+小劑量VRP組⑥K562/A02+DATS+VRP組，每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。小劑量VRP終濃度為1/2 IC10所需濃度。在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)各組細(xì)胞多藥耐藥基因mdrl及凋亡

11、相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3，和NF-κB/p65、IκBα的mRNA表達(dá)7.Western blot檢測(cè)蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/A02細(xì)胞，分別用含10％滅活新生牛血清的RPMI-1640稀釋成1×105/mL，接種于50ml培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)分為：
　　 ①K562組
　　 ②K562/A02組③K562/A02+DATS組④K562/A02+VRP組⑤K562/A02+DATS+小劑

12、量VRP組⑥K562/A02+DATS+VRP組每組平行3瓶。DATS和VRP終濃度為IC10所需濃度。小劑量VRP終濃度為1/2 IC10所需濃度。在37℃，5％CO2，及飽和濕度下培養(yǎng)48小時(shí)。各組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，以鼠抗人Mdr-1抗體、兔抗人NF-κB/p65抗體、鼠抗人IκBα抗體、兔抗人Caspase-3蛋白單克隆抗體作為一抗，二抗為HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的羊抗兔Ig

13、G，DAB顯色，掃描結(jié)果，以密度值反應(yīng)蛋白表達(dá)量。
　　 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單向方差分析的方法。析因設(shè)計(jì)資料采用雙因素分析方法，并繪制交互作用圖，若兩條線(xiàn)是平行的，則說(shuō)明沒(méi)有交互作用。P<0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT檢測(cè)結(jié)果DATS和VRP對(duì)K562/A02細(xì)胞的I

14、C10分別為2.31±0.22μmol/L和4.03±0.13μg/ml。選擇DATS2μmol/L、VRP4μg/ml作為安全范圍藥物劑量用于下面的實(shí)驗(yàn)。以此濃度的DATS和VRP聯(lián)合作用于K562/A02細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，細(xì)胞的生存率為：92.72±3.26％。兩藥合用毒性并無(wú)相加。
　　 不同劑量的DATS聯(lián)合阿霉素(ADM)對(duì)K562/A02細(xì)胞抑制率的具有量效和時(shí)效關(guān)系。
　　 DATS單藥時(shí)對(duì)K562/A

15、02細(xì)胞耐藥逆倍數(shù)為3.789，VRP單藥時(shí)對(duì)K562/A02細(xì)胞耐藥逆倍數(shù)為12.31，聯(lián)合應(yīng)用(2μg/ml)VRP和DATS的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為12.21，聯(lián)合應(yīng)用(4μg/ml)VRP和DATS的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為34.38，證明DATS和VRP聯(lián)合應(yīng)用可以增加逆轉(zhuǎn)作用，且小劑量VRP和DATS聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到大劑量VRP單藥的逆轉(zhuǎn)效果。
　　 2.光鏡下細(xì)胞形態(tài)的改變未加入逆轉(zhuǎn)劑時(shí)，K562/A02細(xì)胞增殖旺盛，核分裂像多見(jiàn)。單獨(dú)應(yīng)用

16、ADM(1μg/mL)作用48小時(shí)，K562/A02細(xì)胞增殖率抑制不明顯。K562/A02+ADM+DATS組培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，核分裂像少見(jiàn)。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，部分細(xì)胞被裂解成數(shù)個(gè)大小不等的小體，細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)凝聚附在核膜周邊，嗜堿性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，可見(jiàn)凋亡小體，部分核碎裂。72小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)目更少，凋亡細(xì)胞比例增加。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度：K562細(xì)胞和K562/A02

17、細(xì)胞內(nèi)自身熒光強(qiáng)度很弱，分別為0.36±0.13和0.59±0.04。K562細(xì)胞經(jīng)ADM處理后，細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度為4.24±0.15，K562/A02細(xì)胞經(jīng)ADM處理后，細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度為2.49±0.27，與K562細(xì)胞比較有顯著性差異(P<0.01)。加入DATS或VRP后，K562/A02細(xì)胞中的ADM熒光強(qiáng)度比加藥前明顯增強(qiáng)(P<0.01)。各加藥組間相比無(wú)顯著性差異。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜P-gp：

18、K562細(xì)胞P-gp表達(dá)率極低(0.53±0.07)，K562/A02細(xì)胞P-gp表達(dá)率高(9.16±1.27)，與K562細(xì)胞有顯著性差異(P<0.01)。加入逆轉(zhuǎn)劑DATS或VRP后，K562/A02細(xì)胞的P-gp表達(dá)率明顯降低(P<0.01)。各加藥組間無(wú)顯著性差異。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡K562/A02細(xì)胞的自然凋亡率是0.90±0.17％，加入DATS后凋亡率為12.15±0.78％，加入VRP后凋亡率為1

19、1.55±1.91％，兩藥合用時(shí)凋亡率為12.55±0.64K562/A02組和各加藥組間均有顯著性差異(P=0.000)。各加藥組間無(wú)顯著性差異。
　　 6.RT-PCR檢測(cè)基因的改變K562/A02組的NF-κB/p65表達(dá)明顯強(qiáng)于K562組(P<0.05)。各加藥組均可以明顯減弱K562/A02細(xì)胞的NF-κB/p65表達(dá)。(P<0.01)。K562組細(xì)胞的IκBα表達(dá)明顯高于K562/A02組細(xì)胞。DATS、VRP單獨(dú)使

20、用對(duì)提高K562/A02組細(xì)胞IκBα的表達(dá)作用不明顯(P=0.4，0.133)。兩藥合用效果優(yōu)于單藥(P<0.05)。DATS對(duì)Bcl-2(P=0.166)、Bax(P=0.062)的表達(dá)作用不明顯。K562/A02細(xì)胞mdr-1表達(dá)明顯高于K562細(xì)胞(P=0.000)。各加藥組均可明顯減弱K562/A02細(xì)胞的mdr-1表達(dá)(P<0.05)。K562細(xì)胞Caspase_3表達(dá)明顯高于K562/A02細(xì)胞(P=0.000)，各加藥組

21、均可以明顯增加K562/A02細(xì)胞的Caspase_3表達(dá)(P<0.01)。
　　 7.Western blot檢測(cè)K562/A02細(xì)胞膜上蛋白表達(dá)的變化：
　　 K562細(xì)胞NF-κB/p65表達(dá)率明顯弱于K562/A02細(xì)胞(P<0.01)，各加藥組均可以明顯減弱K562/A02細(xì)胞的NF-κB/p65表達(dá)(P<0.01)。K562細(xì)胞IκBα表達(dá)明顯強(qiáng)于K562/A02細(xì)胞(P<0.05)。DATS、VRP單用對(duì)I

22、κBα增強(qiáng)作用不明顯(P=0.445，0.117)，兩藥合用效果優(yōu)于單藥(P<0.05)。K562細(xì)胞mdr-1表達(dá)明顯弱于K562/A02細(xì)胞(P=0.000)。各加藥組均可明顯減弱K562/A02細(xì)胞的mdr-1表達(dá)(P<0.05)。K562細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)明顯高于K562/A02細(xì)胞(P<0.05)，各加藥組均可以明顯增加K562/A02細(xì)胞的Caspase_3表達(dá)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：