miR-483在食管癌發(fā)生中的功能研究.pdf

1、背景：
　　食管癌是世界上第八大常見惡性腫瘤,第六大因癌癥導致死亡的原因。目前全世界有45萬多食管癌患者，并且其發(fā)病率仍在上升。食管癌診斷越早，預后越好。然而，由于缺乏有效的早期診斷手段，大部分患者首診時已屆進展期，其總的五年生存率僅為15％~25%，因此有必要探索有應用價值的食管癌分子標志物和靶分子，從而為食管癌的早期診斷和治療提供線索。
　　microRNAs（miRNAs）是一類在進化過程中高度保守的長度在18~25個

2、核苷酸的單鏈非編碼小RNA，主要通過抑制靶基因的翻譯影響人體的各種生理和病理過程。前期我們通過miRNA芯片檢測了25例食管鱗癌及其癌旁組織的差異表達分子，率先發(fā)現(xiàn)并報道了一個食管癌發(fā)生相關的miRNA分子群。其中，miR-483在食管癌組織中高表達，但其對食管癌細胞惡性表型的影響及分子機制尚未闡明，本課題將對此展開研究。
　　目的：
　　1.檢測miR-483-3p在食管鱗癌細胞系及正常食管鱗狀上皮細胞系中的表達；

3、　　2.構建miR-483-3p過表達和低表達的食管癌細胞模型，通過體內外實驗研究miR-483-3p對食管癌生物學行為的影響；
　　3.探討miR-483-3p影響食管癌發(fā)生的分子機制。
　　方法：
　　1.qPCR檢測miR-483-3p在食管鱗癌細胞系及正常食管鱗狀上皮細胞系中的表達；
　　2.構建miR-483-3p的慢病毒表達載體及空載體，轉染食管癌細胞，建立過表達miR-483-3p的細胞模型及相應對

4、照細胞模型；
　　3.合成miR-483-3p inhibitor及inhibitor NC，轉染食管癌細胞，建立低表達miR-483-3p的細胞模型及相應對照細胞模型；
　　4.MTT實驗研究miR-483-3p對食管癌細胞增殖的影響；
　　5.Transwell實驗觀察miR-483-3p對食管癌細胞遷移的影響；
　　6.流式細胞儀檢測miR-483-3p對食管鱗癌細胞周期的影響；
　　7.流式細胞儀檢

5、測miR-483-3p對食管癌細胞凋亡的影響；
　　8.MTT法體外藥物敏感性實驗檢測miR-483-3p對食管癌細胞藥物敏感性的影響；
　　9.裸鼠成瘤實驗觀察miR-483-3p對食管癌細胞體內成瘤能力的影響；
　　10.通過生物信息學及全基因組表達譜芯片聯(lián)合預測的方法篩選miR-483-3p的靶基因；
　　11.通過qPCR、Western blot及雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-483-3p的靶基因。

6、
　　結果：
　　1.與正常食管鱗狀上皮細胞系Het-1A相比，miR-483-3p在食管鱗癌細胞系EC109、EC9706及TE-1中表達升高。
　　2.成功建立了過表達和低表達miR-483-3p的食管癌細胞模型。
　　3.上調miR-483-3p可促進食管癌細胞的增殖、遷移，促進細胞周期由G1期向G2期轉化，減少ADR誘導的細胞凋亡，減弱細胞對化療藥物的敏感性，增強食管癌細胞的體內成瘤能力。
　　4.

7、下調miR-483-3p可抑制食管癌細胞的增殖、遷移，導致細胞周期G1期阻滯，增加ADR誘導的細胞凋亡，增強細胞對化療藥物的敏感性。
　　5.通過生物信息學和全基因組表達譜芯片聯(lián)合預測，得到7個miR-483-3p的靶基因：EI24、KLHL12、GRSF1、MKRN1、LEPROTL1、CREBL2、MAPKAPK2。
　　6.上調食管癌細胞中miR-483-3p的表達對以上7個靶基因的mRNA表達水平無影響。
　　

8、7.上調食管癌細胞中miR-483-3p的表達可導致抑癌基因EI24的表達下降。
　　結論：
　　1.與正常食管鱗狀上皮細胞相比，miR-483-3p在食管鱗癌細胞系中表達升高。
　　2.上調miR-483-3p表達可通過調節(jié)細胞周期促進食管癌細胞的增殖、遷移，增強細胞對化療藥物的耐藥性；下調miR-483-3p則起到相反的效果。
　　3.miR-483-3p可能通過調節(jié)EI24等靶基因的表達影響食管癌的發(fā)生發(fā)展