Calreticulin蛋白在食管癌轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制研究.pdf

1、食管癌的死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中居第四位，鱗狀細(xì)胞癌是我國(guó)食管癌的主要病理類型。為了尋找與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子變化，本課題組前期利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析了食管鱗狀細(xì)胞癌與癌旁正常食管上皮組織的蛋白差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)Calreticulin蛋白在食管癌組織中表達(dá)升高，且Calreticulin蛋白高表達(dá)食管癌患者的五年生存率低于Calreticulin低表達(dá)患者。Calreticulin(CRT)是一個(gè)多功能的鈣離子結(jié)合蛋白，參與蛋白質(zhì)

2、折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的貯存和釋放等多種細(xì)胞生命過(guò)程。對(duì)該蛋白在食管癌細(xì)胞中的作用進(jìn)行深入研究顯示，敲降CRT可抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)穿膜和Matrigel侵襲能力。論文旨在尋找CRT下游調(diào)節(jié)基因，揭示CRT在促進(jìn)食管癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲中的分子機(jī)制。
　　 我們首先在食管鱗癌KYSE150細(xì)胞系中敲降CRT，用cDNA表達(dá)譜芯片分析敲降組與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)錄水平改變的分子。RealtimePCR和Westernblot結(jié)果顯示，敲降CRT后PTPIB

3、在mRNA和蛋白水平均下調(diào)。在CRT缺失的細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CRT(mutant)回復(fù)CRT表達(dá)，PTP1BmRNA和蛋白也隨之上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，CRT通過(guò)調(diào)節(jié)PTPIB轉(zhuǎn)錄影響其表達(dá)。
　　 在食管癌KYSE150細(xì)胞系中，敲降PTP1B后，細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力減弱，黏附和凋亡能力不受影響。在CRT敲降細(xì)胞系中感染Lenti-PTP1B，可逆轉(zhuǎn)由CRT敲降導(dǎo)致的PTP1B降低，PTP1B可以恢復(fù)由于CRT降低導(dǎo)致的

4、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，敲降CRT、PTPIB均可抑制食管癌肺轉(zhuǎn)移。
　　 為了進(jìn)一步研究CRT對(duì)PTP1B的調(diào)控機(jī)制，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析了PTP1B基因上游啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)Stat5a的保守結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示降低CRT蛋白表達(dá)后，可以抑制Stat5a(Tyr694)的磷酸化水平。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，Stat5a結(jié)合于PTP1B基因上游-676到-595位的TT(N)5AA保守序列。提示CRT以作為上游分

5、子，通過(guò)CRT-Stat5a-PTPIB途徑調(diào)節(jié)PTP1B基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 MMPs家族在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，MMP-9是其家族成員之一。我們研究發(fā)現(xiàn)CRT和PTPIB均可以調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)，且CRT敲降細(xì)胞外源感染Lenti-PTP1B，MMP-9回復(fù)升高。Erk1/2為MMP-9轉(zhuǎn)錄因子之一，我們驗(yàn)證了在KYSE150細(xì)胞系中Erk1/2可以調(diào)控MMP-9轉(zhuǎn)錄，而CRT通過(guò)PTP1B影響Erk1/2磷酸化水平，從而影