HIF-1α基因干擾抑制大鼠肝癌CBRH7919細胞HIF-1α及VEGF表達的實驗研究.pdf

1、肝細胞癌是常見的惡性腫瘤之一。全世界45％的原發(fā)性肝癌發(fā)生在我國，位列我國癌癥患者死亡原因第二位。其惡性程度很高，極易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率低，手術(shù)療效較差。即使是小肝癌(＜5cm)行根治術(shù)或肝臟移植術(shù)后，3年內(nèi)復發(fā)率也高達50％以上。肝癌的治療方法很多，包括早期切除、二期切除、經(jīng)肝動脈栓塞化療術(shù)(TACE)、局部消融(微波、射頻等)及適形放療、生物治療、中藥等綜合治療。目前經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療肝癌已成為肝癌非手術(shù)治療的

2、首選方法，但其遠期療效仍欠理想，術(shù)后復發(fā)及轉(zhuǎn)移發(fā)生率較大。如何提高TACE遠期療效，防止腫瘤進展，延長患者生存期是當前的主要研究目標。
　　 目前研究證實導致TACE遠期效果不理想的原因有：腫瘤壞死不徹底，血管新生，復發(fā)轉(zhuǎn)移。研究表明在腫瘤對缺氧缺血反應(yīng)中，HIF-1及VEGF發(fā)揮著重要的作用。
　　 缺氧誘導因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于人體的一種轉(zhuǎn)錄因子，其可激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進靶蛋白的生成并

3、發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，引起細胞對缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)如使細胞無氧酵解加強，促進腫瘤血管的新生并引起腫瘤自身的侵襲性增加和對放化療的抗拒性增加。HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因有60余種，主要有血紅素加氧酶和糖酵解酶等、VEGF、EPO、P53和血小板衍生生長因子β(PDGF-β)等。HIF-1由α亞基和β亞基組成，HIF-1的生理活性是由HIF-1α亞基的活性和表達決定的。
　　 由此可見，HIF-1α在肝癌TACE術(shù)后殘留、復發(fā)轉(zhuǎn)移

4、中發(fā)揮重要的作用，在分子水平沉默HIF-1α表達對提高TACE治療肝癌的療效具有極大的應(yīng)用前景。
　　 RNAi(RNA interference)是現(xiàn)階段最新的基因技術(shù)，它是指通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，從而誘導內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達到阻止基因表達的目的。
　　 目前的研究可以推斷TACE聯(lián)合RNAi技術(shù)抑制HIF-1α基因表達將為肝癌的

5、綜合治療帶來嶄新的研究方向。
　　 大鼠肝癌CBRH-7919細胞株來源于用二乙基亞硝胺(DENA)誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌，可分泌AFP，病理學上為肝細胞性肝癌，具有與肝細胞性肝癌相同的生物學特性。制作成功的大鼠肝癌模型，經(jīng)體表超聲檢查可發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)有腫塊存在，并且可進行介入操作，為動物實驗的操作提供一個好的平臺。
　　 本課題研究利用CoCl2誘導大鼠肝癌CBRH-7919細胞株模擬TACE術(shù)后缺氧環(huán)境，并在模擬缺氧環(huán)境下利

6、用HIF-1αsiRNA敲除HIF-1α基因從而抑制大鼠肝癌細胞模擬缺氧條件下HIF-1α及VEGF的表達，為下一步活體實驗提供體外實驗基礎(chǔ)，為肝癌的綜合治療提供一種新的手段。
　　 第一部分
　　 目的：觀察在不同濃度的CoCl2作用下大鼠肝癌CBRH-7919細胞株HIF-1α及VEGF在轉(zhuǎn)錄水平上各組表達的變化，建立理想的大鼠肝癌CBRH-7919細胞株體外模擬缺氧模型，探討模擬缺氧條件下HIF-1α與VEGF基因

7、表達的相關(guān)性。
　　 方法：本部分采用CoCl2建立模擬缺氧模型。
　　 1、檢測大鼠肝癌細胞株CBRH-7919細胞株模擬缺氧模型中CoCl2合適藥物濃度。
　　 2、 MTT實驗?zāi)M缺氧條件下不同濃度CoCl2對大鼠肝癌細胞存活和生長的影響。
　　 3、 realtime RT-PCR檢測HIF-1α，VEGF的mRNA在模擬缺氧條件下不同時段大鼠肝癌CBRH-7919細胞株中的表達水平。
　　

8、 結(jié)果：
　　 1、模擬缺氧12h條件下濃度為100μmol/L的CoCl2對大鼠肝癌細胞株CBRH-7919細胞株存活及生長無影響；濃度為150μmol/L，200μmol/L及300μmol/L,的CoCl2對大鼠肝癌細胞株CBRH-7919細胞株存活及生長有輕度抑制作用。模擬缺氧24h條件下濃度為100μmol/L及150μmol/L的CoCl2對大鼠肝癌CBRH-7919細胞株存活及生長無明顯抑制作用;濃度為200μm

9、ol/L及300μmol/L的CoCl2對大鼠肝癌細胞株CBRH-7919細胞株存活及生長有明顯抑制作用。
　　 2、 realtime RT-PCR檢測模擬缺氧條件下HIF-1α，VEGF的mRNA的表達情況。模擬缺氧24h，在不同濃度CoCl2作用下，HIF-1α，VEGF表達上調(diào)，以CoCl2濃度為200μmol/L上調(diào)最高，其次是濃度為150μmol/L組。
　　 3、分析正常組與模擬缺氧組之間HIF-1α，VE

10、GFmRNA表達的相關(guān)性，r=0.982，P＜0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用濃度為150μmol/L的CoCl2孵育24h制作的大鼠肝癌CBRH-7919細胞株模擬缺氧模型對大鼠肝癌細胞的生長影響無明顯抑制作用，且HIF-1α，VEGF上調(diào)明顯，能成功建立理想的體外大鼠肝癌CBRH-7919細胞株模擬缺氧模型。
　　 2、模擬缺氧條件下大鼠肝癌CBRH-7919細胞株HIF-1α，VEGF表達明顯上調(diào)，

11、且兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 第二部分
　　 目的：研究HIF-1αsiRNA對模擬缺氧狀態(tài)下大鼠肝癌細胞HIF-1α及VEGF表達的影響，為HIF-1α基因干擾應(yīng)用于動物實驗提供依據(jù)。
　　 方法：本部分采用CoCl2建立模擬缺氧模型。
　　 1、根據(jù)HIF-1α基因序列設(shè)計三對HIF-1αsiRNA、一對陰性對照siRNA及一對陽性對照siRNA。
　　 2、利用陽離子脂質(zhì)體把FAM-siR

12、NA轉(zhuǎn)染入細胞，確保轉(zhuǎn)染效率大于90％。
　　 3、利用陽離子脂質(zhì)體把HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染入細胞，模擬缺氧孵育24h后，realtime RT-PCR檢測HIF-1α，VEGF的mRNA表達的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、在細胞匯合度為30％-50％情況下轉(zhuǎn)染，siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90％-95％。
　　 2、 realtime RT-PCR檢測模擬缺氧條件下，轉(zhuǎn)染siRNA入大鼠肝癌CBRH-7

13、919細胞株后HIF-1α，VEGFmRNA表達情況，HIF-1αmRNA表達下降75％-80％，VEGFmRNA表達下降70％-75％。
　　 結(jié)論：
　　 1、模擬缺氧條件下轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA后，大鼠肝癌CBRH-7919細胞株HIF-1α，VEGFmRNA表達明顯受抑制。HIF-1αsiRNA序列1是干擾效果明顯的小干擾RNA。
　　 2、篩選出一對能高效抑制HIF-1α表達的siRNA序列，為下一