胚胎心臟祖細胞的生物學特性及向起搏細胞的誘導分化.pdf

1、1.研究目的和背景: 種子細胞是組織工程化組織、器官構建,干細胞移植的基礎和關鍵環(huán)節(jié)。心血管領域目前研究應用的種子細胞,以胚胎干細胞(ESC)和骨髓間充質干細胞(BMSC)為主,但前者誘導分化條件復雜、易于成瘤,后者屬于成體干細胞的范疇,壽命有限、活力較差；且作為自體來源的細胞,BMSC必須在發(fā)現病例后才可進行繁瑣的體外細胞培養(yǎng)、擴增,其時效性和有限的生長潛能限制了臨床的廣泛應用。此外,已有的研究均表明上述兩種細胞誘導分化為心血

2、管細胞的比率較低,因此,都不是理想的種子細胞。尋找適宜的種子細胞是開展心血管組織工程、和干細胞移植治療心血管疾患必須解決的首要問題。 從理論上推測,胚胎心臟干/祖細胞發(fā)育時序上更接近心臟的組織細胞,且具有較強的分化增殖能力,因而,誘導分化為心臟的組織細胞更容易。近來研究較多的心臟干/祖細胞主要有三種來源,分別是早期胚胎心臟或心管、成體心臟、ESC所形成類胚體中的心臟原基。后兩者來源的心臟干/祖細胞其分離培養(yǎng)和生物學特性的研究已有

3、較多報道,而從早期胚胎心管分離培養(yǎng)的心臟干/祖細胞生物學特性的研究目前則尚未見報道。從心臟發(fā)育的角度粗略講,早期胚胎心管中存在心肌源性祖細胞和心內膜源性的祖細胞,前者構成了心臟的絕大部分,最終形成各種類型的心肌細胞和傳導細胞；后者在心臟中只占很小一部分,最終分化形成心內膜、瓣膜、隔膜等組織。本課題擬對胚胎心臟祖細胞的生物學特性進行深入研究,以便為心臟組織工程、細胞移植治療心肌梗死、生物心臟起搏器的構建等研究尋找一種理想的新型種子細胞。

4、 2.材料和方法: 2.1人胚胎心臟祖細胞的生物學特性 2.1.1細胞培養(yǎng)和鑒定 2.1.1.1胚胎心臟祖細胞的培養(yǎng)取4周胚齡的藥物流產人胚胎,在解剖顯微鏡下分離心管,將心管在0.25％胰酶中消化分散為單細胞懸液；上述得到的單細胞懸液離心并去上清,使用含15％胎牛血清、0.375％碳酸氫鈉、10ug/L VEGF、106U/L LIF、106U/L青霉素、106U/L鏈霉素、2mmol/L谷安酰氨的高糖DM

5、EM培養(yǎng)液重懸；將重懸的單細胞懸液接種于六孔細胞培養(yǎng)板或者十二孔細胞培養(yǎng)板,細胞長滿后進行傳代擴增。 2.1.1.2胚胎心臟祖細胞的鑒定人胚胎心臟祖細胞的鑒定包括：①形態(tài)學的觀察；②采用免疫熒光的方法檢測Nkx2.5、Is1-1分子標志物的表達：③采用免疫細胞化學的方法檢測平滑肌肌動蛋白、細胞角蛋白、VⅢ因子,C-kit的表達；④RT-PCR檢測GATA-4(心臟特異轉錄因子)的表達。 2.1.2胚胎心臟祖細胞的生物學特

6、性 2.1.2.1胚胎心臟祖細胞的基本生物學特性通過倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特征；通過生長曲線和分裂指數曲線的繪制檢測細胞的生長特性。 2.1.2.2胚胎心臟祖細胞的分化特性 2.1.2.2.1向心肌細胞的誘導分化利用5-氮胞苷誘導第15代胚胎心臟祖細胞向心肌細胞的分化,分別在誘導前、誘導后10天、15天三個時相RT-PCR檢測心肌源性特異基因GATA-4、α-MHC的表達,免疫熒光細胞化學的

7、方法檢測心肌肌動蛋白的表達,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的改變,Western Blot的方法檢測誘導前后細胞心肌肌動蛋白的表達。 2.1.2.2.2向平滑肌細胞的誘導分化與家犬血管內皮細胞共培養(yǎng)誘導胚胎心臟祖細胞向平滑肌細胞方向分化,對誘導前后的細胞免疫熒光檢測α-SMA和MHC-sm的表達,Westem Blot的方法檢測誘導前后細胞α-SMA的表達。 2.2胚胎心臟祖細胞向心臟起搏細胞的誘導分化 2.2.1

8、大鼠胚胎心臟祖細胞的培養(yǎng)250g雌雄SD大鼠配對合籠喂養(yǎng),第二天觀察糞盤是否有陰栓,確定雌鼠受孕開始時間；于受孕后10.5天斷頸處死母鼠,取出子宮在無菌PBS中洗滌,用鑷子撕開子宮和羊膜,分離得到心管；將心管在0.25％胰酶中消化分散為單細胞懸液后,采用與人胚胎心臟祖細胞相同的操作接種、培養(yǎng)、傳代擴增大鼠胚胎心臟祖細胞。 2.2.2大鼠胚胎心臟祖細胞的鑒定大鼠胚胎心臟祖細胞的鑒定包括：①形態(tài)學的觀察鑒定；②采用免疫熒光的方法檢測

9、原代、第5代、第20代細胞Nkx2.5分子標志物的表達；③采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細胞OCT-4分子標志物的表達；④采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細胞階段特異性胚胎抗原SSEA-4分子的表達。 2.2.3大鼠胚胎心臟祖細胞向起搏細胞的誘導分化胚胎心臟祖細胞接種培養(yǎng)兩天后,更換培養(yǎng)基為含有內皮素-1的DMEM,送孵箱進行誘導培養(yǎng),三天后換回正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細胞的搏動情況并錄

10、像。誘導前后的細胞通過免疫熒光的方法檢測HCN2、HCN4、Connexin43、Connexin45、心肌肌動蛋白、Nkx2.5、OCT-4的表達,通過HE染色和電鏡觀察檢測其形態(tài)結構的改變,通過膜片鉗技術檢測其電生理情況。 3.結果: 在本研究中,胚胎心臟祖細胞經內皮素-1誘導五天后,光鏡下直接觀察或HE染色觀察其基本形狀與誘導前相比無明顯改變；但透射電鏡觀察超微結構證實誘導后細胞有了較為明顯的分化；證據之一是誘導后

11、出現較誘導前為多的簡單細胞器結構,包括少量的線粒體、尚不發(fā)達的高爾基體和較不完整的肌絲樣結構,證據之二是誘導后細胞之間可見有連接樣的結構增多。這一超微結構上的變化在免疫熒光染色上得到了進一步的證實,心肌肌動蛋白(細肌絲的主要組成成分)的染色在誘導前后由陰性變?yōu)榱岁栃?縫隙連接蛋白43和45在誘導后也出現了多量的表達。肌動蛋白的表達或肌絲樣結構的出現是誘導后細胞搏動更為明顯的結構基礎,而縫隙連接蛋白的表達則表明誘導后細胞之間更易建立肌電偶

12、聯?？傊?搏動情況和形態(tài)結構上的變化為誘導后細胞已經向起搏細胞方向發(fā)生轉變給出了初步的證據。 起搏細胞之所以具有自動興奮性,是由于在動作電位四期激活產生一種稱為If的內向離子流,導致了細胞的自動除極。編碼If離子流的通道分子稱為超級化激活的環(huán)核苷酸門控的離子通道(hyperpolarization-activated cyclicnucleotide-gated channel,HCN),由于HCN與心臟起搏的產生和調節(jié)關系密切

13、,所以被稱為起搏基因。在本研究中,我們通過免疫熒光染色和RT-PCR檢測了誘導后細胞起搏基因HCN2和HCN4的表達,結果證明了誘導后細胞存在上述兩種起搏離子通道,具備了起搏細胞產生自動興奮的結構基礎。進一步我們利用單細胞膜片鉗實驗檢測誘導后胚胎心臟祖細胞的電生理情況,顯示誘導后細胞出現了連續(xù)的自發(fā)性動作電位(竇房結樣起搏動作電位和心房肌樣起搏動作電位),這一結果最終證明了誘導后細胞可以自發(fā)產生起搏動作電位(自動興奮性),具備了起搏細胞