梅毒螺旋體特異性診斷抗原的篩選、制備及臨床應用初探.pdf

1、目的： 梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum subsp.pallidum,TP)引起的一種危害性極大的全世界流行的性傳播疾病(STD)。采用基因工程抗原建立的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)實驗以其快速、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點在臨床梅毒檢測中得到廣泛的應用，但是，目前的檢測方法仍然存在靈敏性差、假陽性率高、早期梅毒感染的檢出能力較差等缺點，急需尋找新的特異性和靈敏度更高的抗原來提高梅毒早期檢出率。本研究旨在通過生物

2、信息學及基因工程技術篩選、制備梅毒螺旋體多種重組外膜蛋白抗原，探討其在梅毒血清診斷中的價值，為進一步研究開發(fā)臨床檢測效果更好的新型梅毒酶聯(lián)免疫診斷試劑盒提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。 方法 1．通過文獻調(diào)研，篩選出具有良好診斷潛力的梅毒螺旋體特異性外膜抗原。再用生物信息學方法預測上述抗原蛋白的二級結構及抗原決定簇分布情況，分別選定各個抗原中抗原決定簇豐富、抗原性高、特異性高的區(qū)域。 2．根據(jù)篩選的基因(TP17、TP0

3、453、TP0684)，用分子克隆的方法構建重組表達質(zhì)粒pET22b(+)-TP17、pET-28a(+)-TP0453、pET22b(+)-TP0684，轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿菌進行表達，用親和層析、離子交換、凝膠過濾層析等多種方法聯(lián)合純化，獲得純度較高的目的蛋白。 3．將純化后的TPN17、TP0453、TP0684蛋白進行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至NC膜，分別以梅毒標準陽性、陰性血清作為一抗，HRP標記的羊抗人IgG為二抗，進行

4、重組蛋白的免疫印跡分析。 4．以上述純化蛋白為抗原，單獨或聯(lián)合包被酶聯(lián)免疫反應板，建立間接ELISA方法檢測梅毒標準陽性和陰性血清。摸索最適抗原包被組合和包被濃度、最適抗原吸附方式、最適封閉液和封閉時間、最適血清反應時間和反應溫度、最適二抗工作濃度、最適顯色液等條件。 5．用已優(yōu)化的ELIsA檢測體系對各期梅毒病人、正常人、易發(fā)生交叉反應人群、國家質(zhì)控參比血清進行檢測，進行方法學評價。 結果 1．通過生物

5、信息學分析和文獻調(diào)研，選擇TP17、TP0453、TP0684三個梅毒特異性外膜蛋白作為候選診斷抗原，并預測出各個蛋白抗原決定簇較豐富、抗原性較強、特異性高的區(qū)域，分別是：TPN17(22～156aa)、TP0453(29～287aa)、TP0684(30～434aa)。 2．成功構建了能夠高效表達TP17、TP0453、TP0683優(yōu)勢表位區(qū)域的重組表達質(zhì)粒：pET22b(+)-TP17、pET28a(+)-TP0453、pE

6、T22b(+)-TP0684。序列分析與Genbank公布的相應序列完全一致。 3．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，獲得重組工程菌后，經(jīng)IPTG誘導，表達的目的蛋白TP17、TP0453、TP0684分子量約為18kDa、29kDa、43kDa。UVP掃描證實目的蛋白的表達分別約占總蛋白的18％、24％和32％。對表達形式進行鑒定：TP17為可溶形式表達；TP0453、TP0684為包涵體形式表達。 4．用

7、親和層析、離子交換、凝膠過濾層析等方法聯(lián)合對TPN17蛋白進行純化，獲得的蛋白純度>95％；用親和層析方法對TP0453蛋白進行純化，獲得的蛋白純度>90％；用親和層析方法對TP0684蛋白進行純化，獲得的蛋白純度>85％。 5．免疫印跡結果顯示重組蛋白TP17、TP0453、TP0684與梅毒標準陽性血清有良好的免疫反應性，而與梅毒陰性血清不發(fā)生反應。 6．采用不同抗原組合，建立并優(yōu)化ELISA方法，檢測梅毒病人血清，

8、發(fā)現(xiàn)檢測的靈敏度和特異性受抗原種類和組合比例的影響，抗原聯(lián)合使用比單個抗原效果好，其中最適的抗原組合為TP17和TP0453抗原，而TP0684抗原在ELISA檢測中效果不好；最適包被濃度為TP17(0.5μg/ml)+TP0453(μg/ml)；抗原最適吸附方式為37℃孵育4h轉(zhuǎn)4℃過夜；最適封閉條件為1％BSA 37℃封閉2h轉(zhuǎn)4℃過夜；最適血清反應條件為37℃溫育45min；酶標二抗1：15000稀釋；以TMB為最適顯色液底物。

9、 7．經(jīng)各種標本檢測和方法學評價，以TP17和TP0453組合抗原為診斷抗原建立的間接ELISA方法對標準血清盤的檢測靈敏度為94.4％，特異性為97.1％，符合率95.7％，最低檢出限為0.25NCU/ml；與非梅毒血清沒有交叉反應性；與TPPA方法一致性好，特異性高于市場上已有國產(chǎn)ELISA檢測試劑盒。 結論 1．預測出了梅毒螺旋體TP17、TP0453、TP0684三個特異性抗原基因中抗原表位豐富的區(qū)段。

10、 2．高效表達了TP17、TP0453、TP0684三種蛋白，并采用親和層析、離子交換、凝膠過濾層析等多種方法分別對其進行了純化。 3．建立并優(yōu)化了應用TP17、TP0453蛋白作為診斷抗原檢測血清中梅毒特異性抗體的ELISA方法。本方法在初步應用中顯示了較高的特異性和靈敏度，與金標準TPPA方法有優(yōu)良的一致性，為研發(fā)新型梅毒診斷試劑盒奠定了理論和實踐基礎。 4．TP0684在免疫印跡實驗中顯示了良好的免疫反應性，提