芳香烴受體對NLRP3炎癥小體的調控效應和分子機制研究.pdf

1、研究目的:本課題深入研究了AhR對NLRP3炎癥小體的調控效應和分子機制，旨在通過闡明NLRP3分子在轉錄水平的分子調控機制，為尋找防治環(huán)境污染因素造成的炎癥性疾病的免疫調節(jié)療法提供新途徑。
　　材料和方法:
　　1.AhR對NLRP3表達的影響
　　1.1.分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40min，再用LPS刺激不同的時間(O，4h，8h)，Western blot檢測NLRP3、ASC、caspa

2、se-1和IL-1β在蛋白水平的表達變化。
　　1.2.分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40min，再用LPS刺激不同的時間(0，2h，4h)，RT-PCR檢測NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β在mRNA水平的表達變化。
　　1.3.用不同劑量的AhR活化劑TCDD(2nM，10nM，20nM，50nM)和FICZ(20nM，100nM，200nM，500nM)分別刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40

3、min，再用LPS刺激8h，Westem blot檢測NLRP3在蛋白水平的表達變化。
　　1.4.設計合成AhR特異性小干擾RNA，用轉染試劑將靶向AhR的SiRNAAhR-siRNA以及相應的對照CTRL-siRNA轉染入小鼠腹腔原代巨噬細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細胞沉淀，Western blot檢測AhR的蛋白表達情況，明確AhR-siRNA的干擾效率，篩選出抑制效率最佳的干擾片段進行后續(xù)實驗。
　　1.5.用轉染試

4、劑將篩選出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉染入小鼠腹腔原代巨噬細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)48h，用LPS對轉染的細胞進行刺激，并于不同的時間點(0，4h，8h)收集細胞，通過Western blot檢測NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在蛋白水平的表達情況。
　　1.6.用轉染試劑將篩選出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉染入小鼠腹腔原代巨噬細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)48h

5、，用LPS對轉染的細胞進行刺激，并于不同的時間點(0，4h，8h)收集細胞，抽提細胞總RNA，通過RT-PCR檢測NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在mRNA水平的表達情況。
　　2.AhR對NLRP3啟動子區(qū)報告基因活性的影響
　　2.1.使用脂質體分別將PGL3質粒和NLRP3啟動子區(qū)報告基因質粒（nt-2032 tont+166)轉染入小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，24h后分別用D

6、MSO和TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應用報告基因系統檢測分析NLRP3啟動子區(qū)報告基因的活性。
　　2.2.使用脂質體將NLRP3啟動子區(qū)報告基因質粒(nt-2032 to nt+166)轉染入RAW264.7細胞，24h后分別用DMSO、TCDD、FICZ和L-kynurenine(L-kyn)刺激細胞40min，再用LPS刺激6h。應用報告基因系統檢測分析NLRP3啟動子區(qū)報告基因的活性。
　　2.3.分

7、別將AhR的真核表達載體pCMV-Myc-AhR和空載體pCMV-Myc轉染入RAW264.7細胞株，并篩選鑒定出穩(wěn)定高表達AhR的細胞株以及表達相應空載體的細胞株。向兩種細胞中分別轉染入PGL3質粒和NLRP3啟動子區(qū)報告基因質粒(nt-2032 to nt+166)，24h后用LPS刺激細胞6h。應用報告基因系統檢測分析NLRP3啟動子區(qū)報告基因的活性。
　　3.AhR調控NLRP3表達的分子機制
　　3.1.測序分析N

8、LRP3啟動子區(qū)的堿基序列，發(fā)現NLRP3啟動子區(qū)存在3個潛在的AhR結合序列，分別為XRE1(nt-1512to-1504)、XRE2(nt-911 to-904)和XRE3(nt+61 to+67)。構建一系列含NLRP3啟動子區(qū)的不同報告基因質粒，包括:①含NLRP3啟動子區(qū)不同區(qū)域的截斷體質粒-2032(nt-2032 to nt+166)、-1434(nt-1434to nt+166)和-1113(nt-1113 tont+1

9、66);②AhR結合序列缺失的NLRP3啟動子區(qū)突變體質粒ΔXRE-1、AXRE-2和ΔXRE-3;③AhR結合序列突變(GCGTG突變?yōu)锳TACA)的NLRP3啟動子區(qū)質粒mt-1、mt-2和mt-3。
　　3.2.使用脂質體將PGL3質粒和包含NLRP3啟動子區(qū)不同截斷體的報告基因質粒-2032，-1434，-1113分別轉染入RAW264.7細胞，培養(yǎng)24h后用DMSO和TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應用報告基

10、因系統檢測分析NLRP3啟動子區(qū)報告基因的活性。
　　3.3.使用脂質體將PGL3質粒和NLRP3啟動子區(qū)報告基因質粒-2032，或其AhR結合序列缺失的突變體質粒ΔXRE-1、ΔXRE-2和ΔXRE-3分別轉染入RAW264.7細胞，培養(yǎng)24h后，用DMSO、TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應用報告基因系統檢測分析NLRP3啟動子區(qū)報告基因的活性。
　　3.4.使用脂質體將PGL3質粒和NLRP3啟動子區(qū)報告基

11、因質粒-2032，或其AhR結合序列突變的突變體質粒mt-1、mt-2和mt-3分別轉染入RAW264.7細胞，培養(yǎng)24h后用DMSO和TCDD刺激40min，再用LPS刺激6h。應用報告基因系統檢測分析NLRP3啟動子區(qū)報告基因的活性。
　　3.5.用DMSO、TCDD和FICZ刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞1h，應用染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗檢測AhR與NLRP3啟動子區(qū)的結合情況。
　　3.6.用轉染試劑分別將AhR-

12、siRNA或CTRL-siRNA分別轉染入小鼠腹腔原代巨噬細胞，培養(yǎng)48h后分別用DMSO、TCDD和FICZ刺激1h，應用染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗檢測AhR與NLRP3啟動子區(qū)的結合情況。
　　4.AhR對NLRP3炎癥小體活化效應的影響
　　4.1.用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40min，之后用LPS刺激8h，再分別用ATP、nigericin(Nig)和Alum刺激30min。收集細胞裂解液和細

13、胞培養(yǎng)上清，細胞上清用超濾管進行濃縮。Western blot檢測細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液中caspase-1的剪切和IL-1β的分泌，以及細胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和NLRP3的表達情況。
　　4.2.用轉染試劑將AhR-siRNA或CTRL-siRNA分別轉染入小鼠腹腔原代巨噬細胞，培養(yǎng)48h后用LPS刺激8h，再分別用ATP和Nig刺激30min。收集細胞裂解液和細胞培養(yǎng)上清，細胞上清用超濾管

14、進行濃縮。Western blot檢測細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液中caspase-1和IL-1β的分泌，以及細胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和NLRP3的蛋白表達情況。
　　4.3.用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40min，之后用LPS刺激不同的時間（4h和8h），再分別用ATP、Nig和Alum刺激30min。收集細胞培養(yǎng)上清，應用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　

15、　4.4.用不同劑量的TCDD(2nM，10nM，20nM，50nM)刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40min，之后用LPS刺激8h，再分別用ATP和Nig刺激30min。收集細胞培養(yǎng)上清，應用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　　4.5.分別用DMSO、TCDD、FICZ和L-kyn刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞40min，之后用LPS刺激8h，再用ATP刺激30min。收集細胞培養(yǎng)上清，應用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中I

16、L-1β的分泌情況。
　　4.6.用LPS分別刺激pCMV-Myc-AhR質粒的穩(wěn)定轉染細胞系和pCMV-Myc空載體的穩(wěn)定轉染細胞系8h，之后用ATP刺激30min。收集細胞培養(yǎng)上清，應用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　　4.7.用轉染試劑分別將AhR-siRNA和CTRL-siRNA瞬時轉染入小鼠腹腔原代巨噬細胞，培養(yǎng)48h后分別用DMSO和TCDD刺激40min，之后用LPS刺激8h，再分別用AT

17、P、Nig和Alum刺激30min。收集細胞培養(yǎng)上清，應用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。
　　5.體內實驗研究AhR活化對明礬誘導的小鼠腹膜炎的影響。
　　結論:
　　1.AhR的活化能夠顯著抑制LPS誘導的NLRP3在蛋白和mRNA水平的表達。
　　2.AhR能夠與NLRP3啟動子區(qū)的XRE序列結合，抑制NLRP3的轉錄。
　　3.AhR的活化能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體的活化。