去分化表皮細胞重獲再生表皮能力的研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 較大面積重度的全身燒創(chuàng)傷患者，通過皮膚移植等常規(guī)手術(shù)方法，幾乎無一避免會出現(xiàn)創(chuàng)面瘢痕愈合的結(jié)局。雖然表皮干細胞對于嚴重創(chuàng)面修復的組織工程學具有重要幫助，但重度全身燒傷患者殘存的正常皮膚很少，正常皮膚的表皮干細胞數(shù)量本身就很有限，只占正常表皮基底層的1%-10%，干細胞數(shù)量遠達不到修復上述創(chuàng)面的要求，顯然這會明顯限制干細胞組織工程技術(shù)在臨床上的廣泛應用。是否有可以解決表皮干細胞短缺，獲得足量的表皮干細胞將

2、其移植到創(chuàng)面，最終可能實現(xiàn)創(chuàng)面的“完美修復”這樣的方法呢？
　　 去分化就是獲得大量成體干細胞的途徑之一，表皮細胞存在去分化現(xiàn)象。已分化成熟的終末分化表皮細胞通過去分化可以反向分成他們的父輩細胞，也就是說，表皮細胞可以從“年老的”分化狀態(tài)返回到“年輕的”不完全分化、甚至具有表皮干細胞特征的幼稚狀態(tài)的過程。而這些去分化來源的“年輕”細胞可用于上述創(chuàng)面治療。我們?nèi)绾沃鲃拥貙⒁逊只毎隗w外為誘導成為分化程度較低形式的細胞，甚至分化程

3、度更低的再生皮膚能力更強的表皮干細胞呢？
　　 答案是肯定的。有報道，某些特定因素可以誘導表皮細胞去分化。因此，建立可靠而穩(wěn)定的去分化方法將從根本上解決上述疾病治療面臨的表皮干細胞數(shù)量短缺的嚴重問題。去分化方法是一符合道德、倫理規(guī)范的替代方案，沒有遺傳不相容和組織排斥風險。
　　 成熟細胞去分化時涉及幾條復雜的信號通路，如wnt/β-連環(huán)蛋白、p38、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄

4、激活因子(STAT)信號通路。但尚未有研究報告誘導分化表皮細胞退回到有再生能力不成熟狀態(tài)的通路。越來越多的證據(jù)表明，Wnt信號轉(zhuǎn)導對于皮膚的正常發(fā)育十分必要，Wnt信號通路的關(guān)鍵效應器是參與維持皮膚祖細胞群的β-連環(huán)蛋白。研究亦表明，β-連環(huán)蛋白水平升高會導致表皮干細胞增生并誘導細胞轉(zhuǎn)分化為毛囊干細胞。
　　 本研究第一部分是在前期表皮干細胞工作基礎上，繼續(xù)探討并確立穩(wěn)定的表皮干細胞培養(yǎng)體系，為深入去分化研究奠定基礎。第二部分特

5、別針對性探討β-連環(huán)蛋白活化對于分化表皮細胞特性的影響。首先應用氯化鋰(LiCl)和高度特異性GSK-3β抑制劑誘導β-連環(huán)蛋白表達，然后針對β-連環(huán)蛋白活化對于去分化細胞的形態(tài)、表型和生長特性的影響進行觀察，最后對比去分化細胞體外再生表皮的能力。
　　 二、方法
　　 新鮮人包皮片前期處理后，用中性蛋白水解酶分離得到表皮，制成單細胞懸液，用差速貼壁法移去已分化表皮細胞，光鏡和電鏡下觀察表皮干細胞的特點，并使用表皮干細胞

6、標記物鑒定。利用差速貼壁法從表皮片中分離出人體表皮細胞接種于6孔板并分為3組，即對照組(無處理組)，LiCl處理組和GSK-3β抑制劑處理組。應用LiCl和高度特異性GSK-3β抑制劑活化β-連環(huán)蛋白表達，針對β-連環(huán)蛋白活化對于去分化細胞的形態(tài)、表型和生長特性的影響觀察，并對比細胞體外再生表皮的能力。
　　 三、結(jié)果
　　 差速貼壁法分離表皮得到的表皮干細胞具有干細胞的形態(tài)特點，光鏡下細胞貼壁生長，由小圓珠狀漸成方形的

7、鋪路石狀。電鏡下核大，細胞器少，為典型非成熟細胞。2周后原代細胞鋪滿瓶底。用含生長促進因子的DMEM/F12培養(yǎng)的表皮干細胞24h即可伸展貼壁和伸展，原代細胞3-4d即鋪滿瓶底。原代培養(yǎng)的表皮干細胞免疫組化顯示表皮干細胞的系列表面標記物，不表達已分化表皮細胞的標記物CK10。
　　 3組細胞中，免疫印跡和光動力學分析顯示β-連環(huán)蛋白在LiCl組和GSK-3β抑制劑組表皮細胞核內(nèi)的表達較未處理組顯著增高。培養(yǎng)3、6d時，倒置相差顯

8、微鏡下見兩處理組細胞表現(xiàn)為表皮干細胞的典型變化。免疫組化分析表明兩處理組CK10表達的數(shù)量和比例均顯著下降，而表皮干細胞的標記物CK19和β1整合素的表達加強。與對照組相比，Oct4和Nanog基因在去分化的處理組細胞中高4-6倍。3d時兩處理組已明顯的集落形成，而對照組生長稀疏。流式細胞儀檢測出的細胞周期數(shù)據(jù)表明兩處理組中有較多細胞處于增殖期，且與對照組有顯著差異。持續(xù)傳代培養(yǎng)表明兩處理組有更強的遠期增殖潛能。培養(yǎng)11d后，對照組未成

9、表皮單層，但處理組和表皮干細胞組在真皮替代物表面再生了復層表皮。
　　 四、結(jié)論
　　 采用中性蛋白酶選擇性的水解真皮和表皮之間的細胞連接，再用差速貼壁法分離表皮干細胞是一種高效的表皮干細胞獲取方法。含10% FBS低糖DMEM/F12是可以保持表皮干細胞去分化狀態(tài)的良好培養(yǎng)基。
　　 表皮細胞在分化后能夠因β-連環(huán)蛋白的表達增加而重新恢復表皮干細胞的特征。LiCl和GSK-3β抑制劑處理可引起分化后表皮細胞胞核