整合素β1在人表皮細(xì)胞分化中作用的研究.pdf

1、一、研究背景 各種損傷特別是大面積燒傷導(dǎo)致皮膚缺損的治療，是盡快封閉創(chuàng)面，由于自體皮源的不足，常導(dǎo)致治療的失敗。組織工程化皮膚研究一直是當(dāng)前研究的熱點，目前尚無特別有效的皮膚替代物應(yīng)用于臨床。而表皮干細(xì)胞(keratinocytestemcell，KSC)具有強(qiáng)大的增殖能力，又可向各個階段表皮細(xì)胞分化以維持皮膚新陳代謝，因此KSC作為皮膚重建的“種子細(xì)胞”成為研究的熱點。如何在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的KSC用于研究及移植，如何在體

2、內(nèi)外誘導(dǎo)KSC定向分化，對于組織工程皮膚具有重要意義。解決這些問題的關(guān)鍵在于研究KSC增殖與分化的調(diào)控機(jī)制。 整合素β1是KSC未分化的分子標(biāo)記之一，Jones等發(fā)現(xiàn)高表達(dá)整合素β1的表皮細(xì)胞具有更高的克隆形成能力，傳代次數(shù)顯著多于低表達(dá)的細(xì)胞。本室前期通過構(gòu)建整合素β1小RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染KSC，發(fā)現(xiàn)下調(diào)表達(dá)整合素β1蛋白，實驗組克隆形成率比對照組降低，促進(jìn)KSC的分化。提示整合素β1參與KSC的增殖分化的調(diào)控。目前雖然對整

3、合素β1參與KSC增殖與分化的調(diào)控研究比較多，但是整合素β1的表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。 體外實驗研究中，KSC通常從不同的個體分離和純化，存在個體差異和不穩(wěn)定性，因此尋找一種穩(wěn)定細(xì)胞模型對KSC進(jìn)行分化與增殖調(diào)控機(jī)制的研究具有重要意義。HaCaT是來源于正常成人上皮細(xì)胞的表皮細(xì)胞株，具有無限的增殖能力。研究表明，將HaCaT移植到裸鼠上，HaCaT可以形成分化上皮組織，表達(dá)特異性分化蛋白標(biāo)志，因此HaCaT可以為研究人表皮細(xì)胞分

4、化的調(diào)控提供一個非常理想的模型。研究擬應(yīng)用整合素β1啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng)，以HaCaT細(xì)胞為模型，探討表皮細(xì)胞中整合素β1對增殖分化的影響，以及整合素β1的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，為進(jìn)一步研究表皮干細(xì)胞的增殖分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 二、研究目的 1、下調(diào)人表皮細(xì)胞株HaCaT整合素β1，觀察其增殖的情況。 2、研究整合素β1啟動子在HaCaT中的活性，為研究干細(xì)胞分化與增殖調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。 三、研究方法

5、 應(yīng)用本室前期構(gòu)建好的整合素β1小RNA干擾載體轉(zhuǎn)染HaCaT，通過瞬時轉(zhuǎn)染，用Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后HaCaT整合素β1蛋白的改變；通過潮霉素持續(xù)加壓篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，直到轉(zhuǎn)染細(xì)胞株單克隆形成，擴(kuò)大培養(yǎng)，通過計數(shù)法描述其生長曲線。 構(gòu)建和鑒定整合素β1遠(yuǎn)端和近端啟動子雙熒光素酶報告載體，轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞，比較整合素β1遠(yuǎn)端與近端啟動子在HaCaT中的活性，確定其在HaCaT中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的的作用。 四、研究

6、結(jié)果 整合素β1小干擾RNA載體轉(zhuǎn)染HaCaT能夠抑制整合素β1蛋白的表達(dá)，生長曲線右移，HaCaT的增殖受到抑制。 成功的從人基因組擴(kuò)增了整合素β1啟動子全長，并將整合素β1的遠(yuǎn)端與近端啟動子構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體。將整合素β1遠(yuǎn)端與近端啟動子轉(zhuǎn)染HaCaT，熒光素酶活性分析表明，遠(yuǎn)端啟動子在整合素β1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起主要作用。 五、研究結(jié)論 整合素β1參與表皮細(xì)胞株HaCaT的增殖分化調(diào)節(jié)，整合素β1