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文檔簡介
1、目的:探討體外過表達microRNA-30c(miR-30c)對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa及HEC-1-B細胞株生物學行為的影響及其作用機制。
方法:設(shè)計并構(gòu)建能在腫瘤細胞中表達成熟miR-30c的表達質(zhì)粒載體pRNAT-CMV3.2-Neo-miR-30c,以及陰性對照質(zhì)粒pRNAT-CMV3.2-Neo-miR-N,轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌Ishikawa及HEC-1-B細胞株,real-time PCR檢測細胞內(nèi)成熟miR-3
2、0c表達情況。MTT比色法檢測細胞的增殖,流式細胞儀檢測細胞凋亡,人工重組基底膜侵襲小室(Transwell)觀察細胞的侵襲能力。Real-time PCR檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1(MTA1)mRNA表達量,Western Blot檢測MTA13蛋白表達量。設(shè)計并構(gòu)建含有miR-30c與MTA1的3'非編碼區(qū)(3'UTR)可能作用位點序列的PGL3-MTA1-3'UTR及相應陰性對照熒光素酶報告基因載體,并與miR-30c表達質(zhì)粒載體共
3、轉(zhuǎn)染細胞,檢測其熒光素酶活性。
結(jié)果:成功構(gòu)建pRNAT-CMV3.2-Neo-miR-30c表達質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染Ishikawa及HEC-1-B細胞,Real-time PCR證實轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達成熟miR-30c有效。轉(zhuǎn)染pRNAT-CMV3.2-Neo-miR-30c表達質(zhì)粒載體的細胞增殖能力減低,侵襲能力減弱,但凋亡率沒有明顯改變。過表達miR-30c細胞MTA1的mRNA及蛋白質(zhì)表達量均降低。成功構(gòu)建熒光素酶報告基因載
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