USP22對膠質(zhì)母細胞瘤生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、研究背景
　　 多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)起源于星形細胞或星形膠質(zhì)祖細胞，是成人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，在WHO顱內(nèi)腫瘤分類中屬星形細胞腫瘤Ⅳ級。因其具有高增殖和侵襲性行為，病情進展迅速，預(yù)后差。結(jié)合藥物化療和放射治療的手術(shù)治療是經(jīng)典的治療方法，然而化療的毒性反應(yīng)、耐藥問題以及放療副反應(yīng)大，均導(dǎo)致目前多形性膠質(zhì)母細胞瘤治療手段上尚無突破性進展。
　　 在多形性膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生過程中，涉及到許多基因水平的改變，如癌

2、基因的激活和放大，生長因子和(或)其受體的活化等。近年來，有學(xué)者針對膠質(zhì)瘤的代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞通路上的重要靶點進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：原發(fā)性GBM患者常有內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)的擴增和突變、染色體10q雜合性缺失、抑癌基因PTEN變異和P16的缺失等。針對惡性膠質(zhì)瘤癌基因的活化、細胞增殖、凋亡、血管生成或遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)的過度表達，許多學(xué)者采用了不同的靶向治療方案，并取得了一些進展，顯示了基因靶向治療具有良好的應(yīng)用前景。

3、>　　 USP22基因是近年發(fā)現(xiàn)的BMI-1通路上11個標(biāo)記基因中的一個，在人體各組織中均有表達，表達量不等，其編碼的蛋白質(zhì)屬于具有泛素特異性修飾酶家族。已有研究表明，BMI-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的包括USP22在內(nèi)的11個基因具有干細胞樣表達模式，在正常干細胞和部分高度惡性腫瘤細胞中均有表達，與腫瘤的短期內(nèi)復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和治療耐受密切相關(guān)，符合這種轉(zhuǎn)錄模式的癌癥患者在腫瘤早期就表現(xiàn)出高度惡性的臨床行為。USP22作為能夠早期判斷病情和預(yù)

4、測療效的腫瘤干細胞標(biāo)記基因之一，其作用逐漸被認識。近年來的研究讓我們有理由推測USP22高表達可能是膠質(zhì)母細胞瘤錯綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑中的關(guān)鍵點之一，也是潛在的治療靶點。
　　 研究方法
　　 第一部分：通過RT-PCR和westernblot技術(shù)檢測USP22在正常腦組織和膠質(zhì)母細胞瘤中的表達。
　　 第二部分：將病理證實為多形性膠質(zhì)母細胞瘤的組織使用酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)；設(shè)計并合成三對siRNA，分別轉(zhuǎn)染

5、原代培養(yǎng)細胞，通過RT-PCR和westernblot技術(shù)檢測siRNA干擾后USP22的表達，篩選出干擾效果最佳的一對；用篩選出的siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)GBM細胞，利用MTT試驗，驗證RNA干擾對原代培養(yǎng)細胞活性的影響；進而用流式細胞儀檢測USP22-specificsiRNA對細胞周期的影響，并用AnnexinV-FITC和PI雙染色檢測細胞凋亡情況；初步探索參與GBM細胞周期調(diào)控的信號通路。
　　 結(jié)果
　　 1.

6、對GBM患者腫瘤組織以及正常腦組織進行比較，采用westernblot和RT-PCR檢測USP22表達水平。結(jié)果顯示GBM組織中USP22表達水平較正常對照組明顯增高。
　　 2.原代培養(yǎng)的GBM細胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，狀態(tài)良好，免疫熒光顯示細胞內(nèi)GFAP高表達。
　　 3.設(shè)計合成的三對USP22-specificsiRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)分別轉(zhuǎn)染原代細胞后，

7、細胞中USP22表達均下降，其中siRNA-3干擾效果明顯。使用篩選出的siRNA-3轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞，設(shè)置轉(zhuǎn)染control-siRNA的細胞為陰性對照組，MTT法檢測細胞活性，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染USP22-specificsiRNA后，腫瘤細胞的增殖被明顯抑制，48小時、72小時和96小時三個時間點對應(yīng)的細胞存活率分別為(65.1±4.3)％，(53.5±5.2)％和(47.2±4.3)％。而陰性對照組轉(zhuǎn)染controlsi

8、RNA后對腫瘤細胞的增殖沒有明顯的抑制作用。從48小時起，兩組的細胞活性存在明顯差異。
　　 4.轉(zhuǎn)染USP22-specificsiRNA不能明顯增加GBM早期凋亡，提示在GBM中USP22通路可能不是調(diào)控其凋亡能力的主要信號通路。
　　 5.USP22-specificsiRNA作用48小時可以明顯增加G0/G1期細胞比例，這提示USP22-specificsiRNA主要通過誘導(dǎo)G1/S期的周期阻滯和增加細胞死亡來減

9、少GBM增殖。
　　 6.體外實驗中轉(zhuǎn)染USP22-specificsiRNA后，p53、p21和cyclinE的表達水平較對照組未發(fā)生改變，參與GBM細胞周期調(diào)控的信號通路復(fù)雜，具體機制有待進一步研究。
　　 結(jié)論
　　 1.膠質(zhì)母細胞瘤組織中USP22表達在蛋白水平和mRNA水平均較正常腦組織明顯增高。
　　 2.使用酶消化法可獲得生長良好的原代培養(yǎng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞，細胞免疫熒光GFPA陽性。