TLR誘導NF-κB活化上調NLRP3表達的機制研究.pdf

1、目的
　　 NLRP3(NOD-LRRScontainingpyrindomain3)是NLR(NOD-likereceptor)家族成員之一，NLRP3炎癥小體在caspase-1的活化和IL-1β的成熟分泌過程中起重要的作用。目前NLRP3的研究多側重于炎癥小體的活化機制，而NLRP3表達調控機制尚不清楚。本課題研究目的在于闡明NLRP3表達調控的分子機制。
　　 本課題研究發(fā)現在小鼠巨噬細胞內TLR配體能夠上調NL

2、RP3mRNA和蛋白的表達，并且這一上調作用依賴于NF-κB的活化。通過構建一系列NLRP3啟動子區(qū)不同長度的截短突變體熒光報告基因載體，并對其熒光報告基因活性分析，我們在NLRP3啟動子區(qū)找到兩個NF-κB的結合位點(nt-1303to-1292和nt-1238to-1228)，并且用ChIP和EMSA的方法進一步驗證NF-κB和NLRP3啟動子的直接結合作用。本課題闡明了NF-κB和NLRP3啟動子區(qū)nt-1303to-1292和n

3、t-1238to-1228這兩個位點特異性結合，從而上調NLRP3的表達的分子機制。方法
　　 1.檢測TLR配體誘導的小鼠巨噬細胞內NLRP3表達情況
　　 1.1LPS/PGN刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞，RT-PCR和Westernblot檢測NLRP3mRNA和蛋白的表達
　　 1.2LPS/PGN刺激RAW264.7細胞系，RT-PCR和Westernblot檢測NLRP3mRNA和蛋白的表達
　　

4、 2.檢測NF-κB抑制劑(JSH-23)預處理小鼠巨噬細胞，TLR配體誘導的NLRP3
　　 表達情況
　　 2.1NF-κB特異性抑制劑(JSH-23)預處理小鼠原代腹腔巨噬細胞，RT-PCR和Westernblot檢測LPS/PGN誘導的NLRP3mRNA和蛋白的表達
　　 2.2NF-κB特異性抑制劑(JSH-23)預處理RAW264.7細胞系，RT-PCR和Westernblot檢測LPS/PGN誘導的

5、NLRP3mRNA和蛋白的表達
　　 3.雙熒光報告基因分析LPS誘導的NLRP3啟動子活化情況
　　 3.1一系列小鼠NLRP3基因啟動子的克隆以及相應報告基因重組質粒的構建利用TRANSFAC6.0數據庫對NCBI基因數據庫中小鼠NLRP3基因(NT-096135)5'上游3500bp序列進行分析，設計合適的上下游引物，以RAW264.7細胞系基因組DNA為模板，PCR擴增一系列NLRP3啟動子區(qū)DNA片段(nt-3

6、033to+166,-2032to+166,-1733to+166,-1434to+166,-1113to+166，-824to+166)，引入限制性酶切位點KpnI、XhoI，將PCR產物雙酶切克隆入報告基因質粒pGL3-basic，構建6個重組報告基因質粒，并進行雙酶切和測序驗證。
　　 結合基因組數據庫中信息及前期結果，選取小鼠NLRP3啟動子nt-2032to-1434和nt-1434to-1113兩個片段，設計合適引物

7、構建報告基因質粒，構建方法同上，菌液PCR驗證重組載體是否構建成功。
　　 3.2報告基因質粒轉染RAW264.7細胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將構建的8個重組報告基因質粒和不含啟動子和增強子的陰性對照pGL3-basic分別與內參質粒pRL-TK同時瞬時轉染RAW264.7細胞系，24h后加LPS或者PGN刺激8h，然后裂解細胞并收集裂解液，用Promega雙熒光報告基因分析儀對其進行雙熒光素酶活性分析，每組實驗至

8、少重復三次，每次設置3-4個復孔。
　　 3.3報告基因質粒轉染HEK293細胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將構建的8個重組報告基因質粒和不含啟動子和增強子的陰性對照pGL3-basic分別與內參質粒pRL-TK以及pCMV-N-MyD88質?；蛘遬CMV-N-vector同時瞬時轉染HEK293細胞系，24h后裂解細胞并收集裂解液，用Promega雙熒光報告基因分析儀對其進行雙熒光素酶活性分析，每組實驗至少重復三次，

9、每次設置3-4個復孔。
　　 4NLRP3啟動子區(qū)NF-κB結合位點的識別
　　 4.1構建NLRP3啟動子區(qū)預測NF-κB結合位點定點突變報告基因質粒
　　 根據前期結果以及TRANSFAC6.0數據庫分析，在nt-1434to-1113區(qū)間內預測到nt-1303to-1292(A)(AGGGAACCCCCG)和nt-1238to-1228(B)(GGAAAATCCAT)兩個可能的NF-κB結合位點，利用定點突

10、變試劑盒(TOYOBOKOD-Plus-MutagenesisKit)，以NLRP3(-1434/-1113)報告基因質粒為模板對A、B兩個位點進行定點單突變和雙突變，構建NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB、NLRP3(-1434/-1113)MutAB三個重組報告基因質粒，構建和驗證方法同3.2。
　　 4.2突變體報告基因質粒轉染RAW264.7細胞系及雙熒光報告基因分

11、析轉染和雙熒光報告基因分析方法同3.2
　　 4.2突變體報告基因質粒轉染HEK293細胞系及雙熒光報告基因分析轉染和雙熒光報告基因分析方法同3.3。
　　 5體內和體外實驗分析NF-κB與NLRP3啟動子區(qū)的結合情況
　　 5.1凝膠遷移實驗(EMSA)體外分析NF-κB亞基p65與NLRP3啟動子區(qū)結合情況
　　 合成NLRP3啟動子區(qū)nt-1313to-1284段寡核苷酸序列（包含預測NF-κB結合

12、位點A），生物素標記，之后進行EMSA分析。
　　 5.2染色質免疫共沉淀實驗(ChIP)體內分析NF-κB亞基p65與NLRP3啟動子區(qū)結合情況
　　 LPS刺激原代腹腔巨噬細胞1h，用CHIP試劑盒(UpstateBiotechnology，NY)對巨噬細胞染色質進行固定、沉淀、純化，設計包含NLRP3nt-1348to-1183片段的引物，以純化的DNA為模板，進行PCR擴增，之后瓊脂糖凝膠電泳檢測。
　　

13、 結果
　　 1TLR配體上調小鼠巨噬細胞中NLRP3表達
　　 無論是在mRNA還是蛋白水平，無論是在小鼠原代腹腔巨噬細胞中還是在RAW264.7細胞系中，LPS/PGN均能刺激NLRP3的表達上調，且呈一定的時間依賴性。
　　 2TLR誘導的NLRP3表達依賴于NF-κB活化
　　 2.1小鼠原代腹腔巨噬細胞中，在mRNA和蛋白水平上，分別檢測到JSH-23預處理組LPS/PGN誘導的NLRP3表達水

14、平明顯比DMSO對照組低。2.2RAW264.7細胞系中得到與2.1相似的結果，而且JSH-23預處理組LPS/PGN誘導的NLRP3表達消失。
　　 以上兩個結果說明LPS/PGN等TLR配體誘導的NLRP3表達與NF-κB活化有關，當NF-κB通路被阻斷之后TLR配體誘導的NLRP3表達被減弱甚至被阻斷。
　　 3雙熒光報告基因分析明確NF-κB與NLRP3啟動子區(qū)的結合靶位點
　　 3.1小鼠NLRP3啟動

15、子區(qū)一系列截短突變體報告基因質粒的構建及測序驗證
　　 成功構建小鼠NLRP3啟動子區(qū)一系列截短突變體報告基因質粒，經雙酶切及測序驗證插入的片段序列和方向正確無誤，分別命名為NLRP3(-3033)、NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)、NLRP3(-1113)、NLRP3(-834)、NLRP3(-2032/-1434)、NLRP3(-1434/-1113)。
　　 3.2報告基

16、因質粒轉染RAW264.7細胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將上述質粒分別與pRL-TK質粒共轉染進RAW264.7細胞系中，轉染24h后LPS或者PGN刺激8h，收集細胞裂解液做雙熒光素酶報告基因活性分析。報告基因活性分析顯示:LPS刺激組的NLRP3(-3033)雙熒光素酶活性約是不刺激組的4倍，這說明在NLRP3啟動子區(qū)nt-3033to+166之間包含LPS上調NLRP3表達的順式作用元件。其他截短突變體雙熒光報告基因分

17、析結果顯示，NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3（-1434）報告基因活性LPS刺激組分別是其對應不刺激組的5倍、4倍、3倍，而NLRP3(-1113)、NLRP3（-834）報告基因活性在LPS刺激組和不刺激組之間無明顯差異。PGN刺激之后報告基因活性檢測得到相似的結果，這些結果暗示:LPS/PGN上調NLRP3表達的順式作用元件可能位于NLRP3啟動子區(qū)nt-1434to-1113之間，即LPS/PGN刺激

18、RAW264.7細胞，引起的NF-κB入核可能結合于NLRP3啟動子區(qū)nt-1434to-1113之間的某段DNA序列，從而調控NLRP3的表達。LPS刺激組的NLRP3(-1434/-1113)報告基因活性是不刺激組的20倍，LPS刺激之后NLRP3nt-1434to-1113這一區(qū)段的啟動子活性明顯增強，而NLRP3(-2032/-1434)與空質粒對照組一樣在刺激組和不刺激組之間，報告基因活性無顯著差異，這一結果進一步證明了上述結

19、論。
　　 3.3報告基因質粒轉染HEK293細胞系及雙熒光素酶活性分析
　　 將構建的8個重組報告基因質粒和不含啟動子和增強子的陰性對照pGL3-basic分別與內參質粒pRL-TK以及pCMV-N-MyD88質?；蛘遬CMV-N-vector同時瞬時轉染HEK293細胞系，24h后檢測報告基因活性，MyD88轉染組中NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)報告基因活性分別是其對照組

20、的2倍、1.5倍、1.5倍，而NLRP3(-1113)、NLRP3(-834)報告基因活性在MyD88轉染組和對照組均未活化。這更進一步說明了NLRP3啟動子的活化依賴NF-κB的活化，而且NF-κB入核可能結合于NLRP3啟動子區(qū)nt-1434to-1113之間的某段DNA序列，從而調控NLRP3的表達。
　　 4NLRP3啟動子區(qū)NF-κB結合位點的識別
　　 4.1成功構建了NLRP3(-1434/-1113)Mu

21、tA、NLRP3(-1434/-1113)MutB、NLRP3(-1434/-1113)MutAB三個定點突變體重組報告基因質粒
　　 4.2定點突變體報告基因質粒轉染RAW264.7細胞系及雙熒光素酶報告基因活性分析
　　 將上述定點突變質粒分別與pRL-TK質粒共轉染進RAW264.7細胞系中，轉染24h后LPS刺激8h，收集細胞裂解液做雙熒光素酶報告基因活性分析。
　　 報告基因活性分析顯示:LPS可以明顯

22、的增強NLRP3(-1434/-1113)報告基因活性，而且當兩個預測的NF-κB結合位點A、B分別被突變掉之后，LPS仍然能夠增強NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB兩個報告基因活性，但是當兩個預測的NF-κB結合位點A、B同時被突變之后，LPS這一增強作用被減弱，這說明NLRP3啟動子區(qū)nt-1434to-1113之間的A、B兩個位點有可能是LPS刺激引起的NLRP3表達上調的順

23、式作用元件所在的位置，且兩個起協(xié)同作用。
　　 4.3定點突變體報告基因質粒轉染HEK293細胞系及雙熒光素酶報告基因活性分析
　　 無論是A、B兩位點的單突變體還是雙突變體，突變后MyD88轉染組其報告基因活性未被活化，也就是說A、B兩位點突變之后，NF-κB對NLRP3啟動子的活化作用消失了，這更進一步驗證了上述結論。
　　 5體內和體外實驗驗證NF-κB與NLRP3啟動子區(qū)結合
　　 5.1EMSA

24、體外驗證NF-κB與NLRP3啟動子區(qū)結合
　　 選取NLRP3啟動子區(qū)nt-1313to-1284(A)合成DNA雙鏈并進行生物素標記以及EMSA分析，分析結果顯示LPS刺激的腹腔原代巨噬細胞核蛋白能夠在體外跟探針A結合，而且加入P65抗體組出現滯后帶，說明是核蛋白中的NF-κB與探針A特異性結合，這一結果證實了NLRP3啟動子區(qū)nt-1313to-1284(A)在體外與P65的結合作用
　　 5.2ChIP體內驗證N

25、F-κB與NLRP3啟動子區(qū)結合
　　 以純化之后的DNA片段為模板PCR，LPS未刺激情況下，在anti-actin對照組和anti-p65實驗組均無目的帶;而在LPS刺激情況下，在anti-p65實驗組出現明顯的特異性的條帶，這一結果體內驗證NF-κB與NLRP3啟動子區(qū)nt-1348to-1183片段直接結合。
　　 結論
　　 1本課題研究發(fā)現在小鼠巨噬細胞內TLR配體能夠上調NLRP3mRNA和蛋白的表

26、達，并且這一上調作用依賴于NF-κB的活化。
　　 2成功構建一系列NLRP3啟動子區(qū)不同長度的截短突變體及定點突變體熒光報告基因載體，并對其熒光報告基因活性分析，我們在NLRP3啟動子區(qū)找到兩個NF-κB的結合位點（nt-1303to-1292和nt-1238to-1228），這可能是LPS等TLR配體上調NLRP3表達的順式作用元件位置。
　　 3ChIP和EMSA的方法進一步驗證NF-κB和NLRP3啟動子區(qū)的直接

27、結合作用。本課題闡明了NF-κB與NLRP3啟動子區(qū)nt-1303to-1292(A)和nt-1238to-1228(B)這兩個位點特異性結合，從而上調NLRP3的表達的這一分子機制。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組成部分，在機體免疫反應和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。炎癥小體的研究成為世界范圍內的一個研究熱點，NLRP3作為炎癥小體重要的組成部分，其表達調控分子機制目前尚不清楚。文獻報道

28、，TLR信號通路活化能夠誘導人單核細胞中NLRP3表達，與此相一致，我們在小鼠巨噬細胞中也發(fā)現TLR配體LPS/PGN能夠誘導NLRP3的表達，因此我們?yōu)檠芯縉LRP3表達調控建立了一個相對穩(wěn)定的體系。
　　 TLR和NLR是兩種最重要的模式識別受體，最近的研究表明，TLR和NLR兩條信號通路之間的交互作用對固有免疫調節(jié)起到至關重要的作用。我們的研究證實了TLR配體可以上調NLRP3的表達，這提供了TLR和NLR兩條信號通路之間

29、存在交互作用的一個實例。
　　 本課題運用基因工程技術成功構建了一系列NLRP3啟動子區(qū)的報告基因質粒，分析LPS/PGN等對NLRP3活化的影響，確定了TLR配體激活的NF-κB信號通路作用于NLRP3啟動子區(qū)的nt-1303to-1292和nt-1238to-1228這兩個靶位點，并運用EMSA和CHIP進一步驗證。本課題闡明了炎癥相關因子NLRP3的表達調控機制，填補了這一研究領域的空白，為炎癥相關疾病的治療提供了可能的理