星形膠質細胞對骨髓基質干細胞增殖及分化的作用研究.pdf

1、近幾十年來，中樞神經系統疾病（如創(chuàng)傷、神經退行性疾病、腦血管病等）的發(fā)病率逐年增加，其致殘率和死亡率較高，而成體中樞神經系統自身的再生能力較弱，目前臨床只能對癥治療，尚無有效的治療方法。近年來，干細胞（stem cells）移植療法逐漸成為治療中樞神經系統疾病的一種有前途的治療措施。 干細胞是一類具有自我更新、自我復制能力和多向分化潛能的細胞，在合適的條件下，可以分化為不同類型的具有特定形態(tài)、特定分子標志和特殊功能的成熟細胞。骨

2、髓基質干細胞（bone marrow stromal stem cel1s，BMSCs）是來源于骨髓的一種干細胞。BMSCs可從自體骨髓取材、來源充足、取材方便，是治療性干細胞移植中比較理想的種子細胞。 近年來研究發(fā)現，BMSCs不僅可分化為成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞等間充質來源的細胞，在合適的培養(yǎng)條件下，BMSCs還可橫向分化為神經細胞；并在不同的體內微環(huán)境或體外誘導條件下，分化為不同遞質類型的神經細胞。因此，BMSCs有望

3、成為干細胞移植治療神經系統疾病的理想種子細胞，具有廣闊的臨床應用前景。 星形膠質細胞是中樞神經系統內數量最多的一類細胞，也是中樞神經系統微環(huán)境的主要構成成分。研究發(fā)現，星形膠質細胞不僅對神經元提供營養(yǎng)、支持、保護、隔離作用，在神經元的發(fā)育、軸突再生、突觸形成和信號傳遞以及干細胞的分化等方面也發(fā)揮著重要作用。 實驗證明，中樞神經系統損傷或發(fā)生神經退行性疾病后，炎癥反應非常明顯，星形膠質細胞的激活并分泌一系列炎性細胞因子是這

4、種炎癥反應的重要標志。這種炎癥反應所形成的微環(huán)境對神經組織中固有的神經干細胞或移植的骨髓基質干細胞會產生什么影響，至今仍不得而知。 本研究利用體外建立的星形膠質細胞炎癥模型，研究了激活的星形膠質細胞對骨髓基質干細胞增殖及分化的影響，并對其作用機制進行了初步探討。 一、骨髓基質干細胞的分離、培養(yǎng)和體外擴增 由于骨髓中細胞成分復雜，且BMSCs在骨髓中的含量很少，約105個骨髓單個核細胞中僅含2～5個BMSCs，因而

5、BMSCs的分離、培養(yǎng)、純化和體外擴增的難度較大。 根據BMSCs密度比較低和容易貼壁生長的特點，首先用密度為1．077g/ml的淋巴細胞分離液將大部分的造血細胞去除，然后通過貼壁培養(yǎng)、定期換液去除懸浮生長的造血細胞，使用低糖DMEM培養(yǎng)液（含10％FBS）培養(yǎng)擴增。原代培養(yǎng)7天左右，BMSCs可形成明顯的細胞集落；細胞生長至80％～90％融合時用0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA消化，傳代培養(yǎng)。傳至3代時，細胞基本純化，形

6、態(tài)趨于一致，呈長梭形。由于BMSCs缺乏專一的特異性抗原標志，本實驗應用流式細胞儀檢測了多種細胞表面抗原，以便確認BMSCs。檢測結果顯示：幾乎所有的培養(yǎng)細胞，其表面抗原CD29和CD90呈陽性，說明培養(yǎng)的細胞為較純的BMSCs。 二、炎性星形膠質細胞條件培養(yǎng)基對BMSCs增殖及分化的影響 在成功培養(yǎng)BMSCs的基礎上，為模擬中樞神經系統體內炎性微環(huán)境下星形膠質細胞細胞對BMSCs增殖及分化的影響，我們首先分別收集加入脂

7、多糖（LPS）培養(yǎng)12、36、72h后的星形膠質細胞上清液作為炎性星形膠質細胞條件培養(yǎng)基（astrocyte conditioned medium，ACM，分別稱為12h ACM、36h ACM、72h ACM），同時收集無LPS的星形膠質細胞上清液作為正常星形膠質細胞條件培養(yǎng)基（normal ACM，N-ACM），然后將收集的條件培養(yǎng)基加入BMSCs的培養(yǎng)中，觀察細胞的增殖及神經分化情況。 細胞增殖實驗結果顯示，和N-ACM相

8、比，炎性星形膠質細胞條件培養(yǎng)基（12hACM、36h ACM、72h ACM）可明顯促進BMSCs的增殖，36h ACM的促增殖作用明顯強于12h及72h ACM兩組。神經分化結果表明，和N-ACM相比，炎性條件培養(yǎng)基可使BMSCs向神經元和神經膠質細胞分化率明顯升高，36h ACM組的神經元陽性細胞比例明顯高于12h ACM和72h ACM兩組；而神經膠質細胞的分化率，12h ACM、36h ACM、72h ACM三組無明顯差異。

9、 三、炎性星形膠質細胞條件培養(yǎng)基調節(jié)BMSCs增殖及分化的機制研究 第二部分的實驗結果表明，炎性星形膠質細胞可促進BMSCs的增殖及神經分化，炎性星形膠質細胞的這種促進作用可能是通過分泌的各種因子而實現的。本實驗重點檢測了白細胞介素-6（IL-6）。以往的實驗證實，作為一種多功能的炎性細胞因子，IL-6在各種中樞神經系統創(chuàng)傷或疾病中的表達明顯增加，并在神經發(fā)育及再生等過程中發(fā)揮重要作用。為明確IL-6在炎性星形膠質細胞誘導的

10、BMSCs增殖及神經分化過程中的作用，我們首先檢測了炎性星形膠質細胞合成和分泌IL-6的情況。ELISA檢測結果顯示，炎性星形膠質細胞培養(yǎng)基中IL-6的含量明顯增多，且36h ACM中IL-6的含量明顯高于12h和72h ACM，RT-PCR結果與此相一致。當在培養(yǎng)基中添加特異性IL-6抗體以阻斷IL-6的作用時，BMSCs的增殖明顯減少，BMSCs向星形膠質細胞方向分化的趨勢也明顯減弱，但BMSCs向神經元方向分化明顯增多，說明IL-