WT1基因異構(gòu)體對白血病細胞生物學行為影響的研究.pdf

1、目的:優(yōu)化懸浮培養(yǎng)的白血病細胞電穿孔轉(zhuǎn)染的條件.將攜帶WT1基因四種異構(gòu)體全長cDNA的真核表達載體轉(zhuǎn)導白血病細胞株NB<,4>,建立穩(wěn)定表達的單克隆細胞株.探討WT1基因及其異色體對急性早幼粒細胞性白血病細胞株NB<,4>增殖、分化、凋亡等生物學行為的影響及其分子機制.方法:通過調(diào)整電壓、電容、細胞狀態(tài)、溫度及緩沖液等不同轉(zhuǎn)染條件,以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因,用流式細胞儀和熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,優(yōu)化懸浮培養(yǎng)白血病細胞的電穿孔

2、轉(zhuǎn)染條件.用電穿孔的方法分別將對照質(zhì)粒pCB6+及攜帶WT1基因四種主要異構(gòu)體WTA(-17aa/-KTS)、WTB(+17aa/-KTS)、WTC(-17aa/+KTS)、WTD(+17aa/+KTS)全長cDNA的真核表達載體轉(zhuǎn)導白血病細胞株NB<,4>,建立穩(wěn)定表達外源基因的細胞株并用有限稀釋法進行單克隆化.采用臺盼藍拒染法、MTT比色法、甲基纖維素集落形成試驗及細胞周期動力學檢測, 了解表達外源性WT1基因異構(gòu)體WTA從而將WT

3、1基因異構(gòu)體表達的比例由+17AA/+KTS優(yōu)勢型轉(zhuǎn)變?yōu)?17AA/-KTS優(yōu)勢型對NB<,4>細胞生長的影響.通過形態(tài)學觀察,NBT還原試驗,細胞表面分化抗原CD11b的檢測了解外源性表達WT1基因異構(gòu)體WTA對NB<,4>細胞分化的影響.用DNA凝膠電泳,流式細胞儀測定AnnexinV結(jié)合力等方法觀察WT1基因異構(gòu)體表達比例的轉(zhuǎn)變對白血病細胞NB<,4>誘導凋亡的作用.用RT-PCR方法檢測WT1基因異構(gòu)體WTA轉(zhuǎn)導NB<,4>細胞

4、后,NB<,4>細胞PML/RARα、RbAP46、P21、P53、Bcl-2、Bcl-XL、VEGF和C-myc等相關基因表達的改變.運用cDNA微陣列技術檢測WT1基因異構(gòu)體表達比例的轉(zhuǎn)變對NB<,4>細胞基因表達譜的影響.并用RT-PCR方法驗證CyclinA1及CDK7基因表達的改變.結(jié)論:①WT1基因異構(gòu)體能夠通過電穿孔的方法成功轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的白血病細胞NB<,4>,并建立單克隆化的永久表達細胞株.②增加外源性WT1基因異構(gòu)體

5、WTA的表達從而將WT1基因異構(gòu)體表達的比例由+17AA/+KTS優(yōu)勢型轉(zhuǎn)變?yōu)?17AA/-KTS優(yōu)勢型能抑制白血病細胞株NB<,4>的增殖,使其克隆形成能力明顯下降.同時也能部分抑制ATRA對NB<,4>細胞的誘導分化作用,使NB<,4>細胞對As<,2>O<,3>引起的凋亡更為敏感.這些改變可能與PML/PARα、P21、C-myc等基因的表達上調(diào),Bcl-2基因的表達下調(diào)有關.③WT1基因異構(gòu)體WTA表達比例增加能引起NB<,4>