白藜蘆醇抑制Raji細胞的增殖及誘導細胞凋亡的機制研究.pdf

1、研究背景
　　 淋巴瘤起源于淋巴結和淋巴組織，其發(fā)生大多與免疫應答過程中淋巴細胞增殖分化產生的某種免疫細胞惡變有關，是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。按組織病理學改變，淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma，NHL)。非霍奇金淋巴瘤是血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其病死率高，傳統(tǒng)化療副作用大，患者多不能長期堅持，且復發(fā)率高；造血干細胞移植費用較高，資源有限，限制了其

2、在臨床的廣泛應用。因此新型的低副作用的抗腫瘤藥日漸受到人們關注。
　　 熱休克蛋白(HSPs)是早在1962年就被發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的蛋白，不同情況的應激均能誘導它。隨后人們又發(fā)現(xiàn)HSPs可以作為其他細胞內蛋白質的分子伴侶，對后者有很好的保護作用。在HSP家族中最重要、誘導后表達量最大的是HSP70家族，為廣泛分布在細胞的亞細胞結構中的可溶性蛋白。HSP70通過與其客戶蛋白質的結合或減弱或增強蛋白質活性，以應付外界壓力。HSP7

3、0在正常細胞中不表達或表達量很低，但在腫瘤細胞中高表達。大量實驗表明，熱休克蛋白能通過其分子伴侶功能，影響腫瘤細胞中的細胞周期蛋白，激酶等的活性，從而影響到腫瘤細胞的生長，表現(xiàn)為抗凋亡的作用。
　　 通過影響HSP70而達到抗腫瘤的作用已成為人們關注的焦點。AliAghdassi等研究HSP70在胰腺癌中的作用證實HSP70在胰腺癌中較正常細胞中高表達且其高表達阻礙了腫瘤細胞的凋亡，并發(fā)現(xiàn)選擇性下調HSP70的表達能誘導胰腺癌細

4、胞的凋亡并能減輕小鼠移植瘤的大小及重量，同時發(fā)現(xiàn)在下調HSP70的過程中伴隨著凋亡信號分子caspase-3和caspase-9的激活，認為此機制是HSP70抑制劑的抗腫瘤作用機制之一。
　　 白藜蘆醇是從多種葡萄屬植物中提取的多酚類化合物，具有抗炎，抗菌，抗腫瘤等作用。白藜蘆醇作為一種化學預防劑及心臟保護制劑日漸受到人們關注，也有人認為其可以直接作為抗腫瘤藥物。Clement等早在1998年就發(fā)現(xiàn)一定劑量的白藜蘆醇可以誘導HL

5、-60細胞發(fā)生凋亡。PrabirK等最近發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能通過抑制HSP70的表達誘導K562細胞凋亡，并能增加17-AAG對K562細胞的抗腫瘤作用，實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能降低細胞核內HSF1的水平而升高胞漿內HSF1的水平，這阻止了HSF1的核定位，從而從基因水平下調HSP70的表達，這可能是白藜蘆醇抗腫瘤或增敏的主要機制。
　　 白藜蘆醇對非霍奇金淋巴瘤的作用國內外尚無報道，本實驗旨在研究白藜蘆醇對非霍奇金淋巴瘤細胞raji細胞系

6、是否具有抗腫瘤作用，并初步探討其抗腫瘤的作用是否因為下調HSP70的表達所致，為進一步闡明白藜蘆醇抗淋巴瘤的作用機制提供依據(jù)。因此本實驗研究分以下兩部分：
　　 1.白藜蘆醇對非霍奇金淋巴瘤細胞系raji細胞增殖及凋亡的影響。
　　 2.HSP70在raji細胞中的表達情況及白藜蘆醇對raji細胞中HSP70表達的影響。
　　 第一章：白藜蘆醇對raji細胞增殖及凋亡的影響研究
　　 目的：
　　

7、 研究白藜蘆醇對淋巴瘤raji細胞增殖及凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)與分組：raii細胞培養(yǎng)于含10％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　 2.CCK8法檢測細胞活性：收集對數(shù)生長期細胞，用CCK-8法檢測細胞活性。
　　 3.流式細胞儀檢測細胞凋亡比例及分析細胞周期分布：收集待檢測細胞，用FACS流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數(shù)，觀察凋亡細胞百分比；收集待檢測細胞，用流

8、式細胞儀分析細胞周期分布。
　　 結果：
　　 白藜蘆醇能明顯抑制淋巴瘤raii細胞的增殖，作用呈現(xiàn)濃度及時間依賴性，其機制可能是影響了細胞周期，造成細胞周期阻滯；白藜蘆醇能明顯誘導淋巴瘤raji細胞的凋亡，作用呈現(xiàn)濃度及時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：白藜蘆醇能濃度及時間依賴性的抑制淋巴瘤raji細胞的增殖及誘導其凋亡，其抑制增殖的機制可能是白藜蘆醇導致了細胞周期阻滯。
　　 第二章：HS

9、P70在raji細胞中的表達情況及白藜蘆醇對其表達的影響研究
　　 目的：
　　 研究raii細胞與正常人外周血單個核細胞中HSP70表達的差異；檢測白藜蘆醇處理raji細胞后HSP70表達的情況。
　　 材料與方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)與分組：raji細胞培養(yǎng)于含有10％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。3例健康獻血員外周靜脈血用密度梯度離心法分離得單個核細胞為正常對照組。
　　 raji細

10、胞先分五組：白藜蘆醇0、40、100、160、250μmol/L處理raji細胞；后取白藜蘆醇100μmol/L處理raji細胞后分0h、24h、48h、72h分別用于Westernblot及RT-PCR檢測；
　　 2.Westernblot檢測：
　　 2.1檢測腫瘤細胞raji細胞與3份正常外周血淋巴細胞的HSP70的蛋白相對表達水平。
　　 2.2白藜蘆醇0、40、100、160、250μmol/L處理r

11、aji細胞后48h用Westernblot檢測raji細胞中HSP70的表達情況。
　　 2.3白藜蘆醇100μmol/L處理raji細胞后分0h、24h、48h、72h，用Westernblot檢測HSP70的表達情況。
　　 3.RT-PCR檢測：白藜蘆醇100μmol/L處理raji細胞后分0h、24h、48h、72h，用RT-PCR檢測HSP70mRNA的表達情況。
　　 結果：
　　 淋巴瘤ra