葡萄漆酶的畢赤酵母異源表達純化及酶學(xué)特性與功能研究.pdf

1、漆酶(EC.1.10.3.2)全稱為對-二酚:（雙）氧氧化還原酶，目前發(fā)現(xiàn)，漆酶廣泛存在于真菌、細菌、植物和昆蟲中。目前對植物漆酶的研究相對較少，但其在木質(zhì)素合成、抗病、抗逆，及色素合成等方面研究已取得了一定的成果。葡萄（Grapes），葡萄屬(Vitis)落葉藤本植物，幾乎占據(jù)全世界水果產(chǎn)量的四分之一。葡萄的營養(yǎng)價值很高，其中含有大量的蛋白質(zhì)、葡萄糖、果糖、酒石酸、草酸及很多微量元素。至今還沒有有關(guān)葡萄漆酶的研究報道，因此我們合成了葡

2、萄的漆酶基因，通過畢赤酵母分泌表達，研究葡萄漆酶的酶學(xué)特性與功能。本研究證明葡萄漆酶在含有染料和酚類化合物的工業(yè)污水治理上具有重要應(yīng)用價值，同時為探索葡萄漆酶在葡萄中的功能提供了理論基礎(chǔ)。
　　本文根據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的葡萄漆酶基因（VvLCC）序列，按畢赤酵母偏愛密碼子的偏好性進行改造，用PTDS基因合成法合成適合于甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母表達的葡萄漆酶基因，命名為VvLCCI。為進一步研究葡萄漆酶的酶學(xué)特性及相關(guān)功能，用電擊的

3、方法把含有目的基因（VvLCCI）的真核表達載體pYN2460轉(zhuǎn)化到畢赤酵母基因組中，G418和PCR篩選鑒定出表達活性最高的陽性酵母菌株，將篩選出的菌種用20％甘油保存于-70℃冰箱中。用BMGY和BMMY培養(yǎng)基進行酵母菌株培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)表達，離心留上清，上清液即為所要的粗酶液，粗酶液在4℃低溫下過Ni+柱純化。用純化的重組葡萄漆酶研究酶的動力學(xué)常數(shù)和酶學(xué)特性，金屬離子和化合物對漆酶活性的影響，染料脫色和2，4，6-TCP降解。研究結(jié)

4、果闡明重組葡萄漆酶的最適pH和最適溫度分別為3.0和40℃，漆酶在酸性pH和溫度低于75℃條件下很穩(wěn)定;Cu2+對葡萄漆酶活性有很強的促進作用，而Fe2+、L-半胱氨酸和硫代硫酸鈉對葡萄漆酶活性有很強的抑制作用;對底物ABTS和愈創(chuàng)木酚的米氏常數(shù)Km分別為0.0923和16.8mM，Vmax分別為39.55和10.79mMmg-1min-1。在最佳反應(yīng)條件下，0.6mM的2，4，6-TCP與葡萄漆酶反應(yīng)7.5h后降解了87.2％，同時葡