HLA-A33分子的體外表達及鑒定.pdf

1、人類白細胞抗原（HLA）是一種重要的遺傳物質，是目前所知人體最復雜的多態(tài)系統(tǒng)。在我國人群中A33表位占A位點表位的21％，是臨床中較常見的表位。根據近些年相關報道，HLA-A33表位在多種疾病的病程進展過程中起著重要作用。在我國南方以及Korea統(tǒng)計的結果，HLA-A33與HBV感染后慢性化有較明顯的相關性；Luan-Yin Chang博士等的研究表明，HLA-A33型為EV71易感基因型；洪軍等人的研究表明，HLA-A33與小兒急性淋

2、巴細胞白血病有遺傳相關性（曹海霞等 2007）。本研究通過構建HLA-A33表達載體，經重組載體的鑒定、載體的轉化及轉染、目的蛋白的原核表達及表達水平的檢測，初步研究HLA-A33分子與EV71病毒分子之間的相互作用，為研究HLA-A33在相關疾病中的致病作用和免疫機制提供理論基礎和實驗依據。本研究分為兩部分：
　　 第一部分：建立穩(wěn)定表達HLA-A33分子的細胞系及其功能的相關研究。從GenBank查閱人類HLA-A33的基因

3、序列，結合真核表達的特點，優(yōu)化所得序列的密碼子，并且添加必要的限制性酶切位點Nhe I、Xho I及Flag標簽蛋白。通過四質粒慢病毒系統(tǒng)將目的基因片段整合到宿主細胞的基因組DNA上。構建的穩(wěn)定細胞系通過puro篩選可穩(wěn)定傳代的細胞，通過IF，WB，PCR等方法鑒定細胞系。用EV71病毒感染所獲得的穩(wěn)定細胞系，嘗試通過CoIP尋找HLA-A33與EV71之間存在相互作用的蛋白質。
　　 第二部分：HLA-A33基因在原核細胞中表

4、達及檢測。根據原核表達的特點重新優(yōu)化密碼子，選擇pET28a作為表達載體，在序列兩端添加Nco I和BamH I限制性酶切位點，通過T4連接酶將載體和序列連接，化學轉化法轉入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，得到大量克隆并用PCR和測序鑒定目的基因的插入情況。將重組質粒重新轉化入表達菌柱BL21（DE3），通過IPTG誘導表達，SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍成像來檢測HLA-A33蛋白在原核細胞內表達情況。原核表達的蛋白添加了BirA

5、酶底物肽和鏈親和素標簽Streptavidin，為后續(xù)構建HLA-A33分子的tetramer四聚體提供實驗基礎。
　　 本研究取得了如下成果：用常用的分子克隆技術成功構建了HLA-A33的原核表達載體，實現HLA-A33蛋白在原核細胞內的高效表達，并對表達蛋白進行了檢測分析；利用慢病毒系統(tǒng)轉染法獲得了HLA-A33穩(wěn)定細胞系并利用穩(wěn)定細胞系初步進行EV71與HLA-A33相互作用蛋白的分析。實驗的成果對于HLA-A33的后續(xù)研