生化1-蛋白質

1、生 物 化 學,授課教師：盧韞 淮南師院化生系,,三 蛋白質,第B章 蛋白質化學,蛋白質的生物學意義,蛋白質的元素組成,蛋白質的氨基酸組成,肽,蛋白質的結構,蛋白質分子結構與功能的關系,蛋白質的性質,蛋白質的分類,提要,蛋白質 是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構象并具有一定生物功能的大分子。,一、蛋白質的生物學意義,1. 生物體的組成成分,2. 酶,3. 運輸,4. 運動

2、,5. 抗體,6. 干擾素,7. 遺傳信息的控制,8. 細胞膜的通透性,9. 高等動物的記憶、識別機構,二、蛋白質的元素組成,C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、 S（0~4%）、…,N的含量平均為16%——凱氏（Kjadehl）定氮法的理論基礎,三、蛋白質的氨基酸組成,氨基酸 是蛋白質的基本組成單位。從細菌到人類，所有蛋白質都由20種標準氨基酸（20 standard amino acids)

3、組成。,（一）氨基酸的結構通式：19種氨基酸具有一級氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結合到α碳原子（Cα），同時結合到（Cα）上的是H原子和各種側鏈（R）；Pro具有二級氨基（α-亞氨基酸）,Cα如是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構體 [D-型和L-型]2. 具有旋光性 [左旋（-）或右旋（+）],（二）氨基酸的分類,根據R的化學結構（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、C

4、ys；2）極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）雜環(huán)氨基酸：Trp、His（4）雜環(huán)亞氨基酸：Pro,根據R的極性（1）極性氨基酸：1）不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）帶正電：His、Lys、Arg；3）帶負電：Asp、Glu（2）非極性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,氨基酸類別,非

5、蛋白質氨基酸,蛋白質氨基酸（20種）,酸性氨基酸,天冬氨酸,谷氨酸,堿性氨基酸,賴氨酸,組氨酸,精氨酸,中性氨基酸,極性氨基酸,非極性氨基酸,絲氨酸,蘇氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰氨,谷氨酰胺,,丙氨酸、甘氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,苯丙氨酸,,甲硫氨酸,色氨酸,脯氨酸,頡氨酸,,,,,,,（三）氨基酸的重要理化性質,一般物理性質 無色晶體，熔點極高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差別較大（極性和非極

6、性），不溶于有機溶劑。,兩性解離和等電點 氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質子的—NH3+正離子和能接受質子的—COO-負離子，為兩性電解質。,3. 化學性質,（1）與茚三酮的反應：Pro產生黃色物質，其它為藍紫色。在570nm（藍紫色）或440nm（黃色）定量測定（幾μg）。,調節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時

7、，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。,（當氨基酸相互連接成蛋白質時，只有其側鏈基團和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。,氨基酸等電點的確定：,1）酸堿滴定（滴定曲線）,2）根據pK值（該基團在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側pK值的算術平均數。,（2）與甲醛的反應：氨基酸的甲醛滴定法,OH-,中和滴定,（3）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應,,弱堿性,DNP-氨基酸,取代

8、DNFB測定蛋白質N端氨基酸，靈敏度高,（4）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應,,pH8.3,,無水HF,重復測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設計出“多肽順序自動分析儀”,（5）與熒光胺反應：根據熒光強度測定氨基酸含量（ng級）。激發(fā)波長λx=390nm，發(fā)射波長λm=475nm。,（6）與5,5′-雙硫基-雙（2-硝基苯甲酸）反應：,硫代硝基苯甲酸,測定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩爾消光系數ε=13600）,四、肽,——一個

9、氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合而成的化合物。 氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）。,當兩個氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，在一端仍然有游離的氨基和另一端有游離的羧基，每一端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長的、不帶支鏈的寡肽（25個氨基酸殘基以下）和多肽（多于25個氨基酸殘基）。多肽仍然有游離的α-氨基和α-羧基。,肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“-”表示

10、肽鍵。,,H2N-絲氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH,Ser-Leu-Phe,（S-L-F）,（一）谷光甘肽（GSH）,2GSH,GSSG,（二）催產素和升壓素,均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產和促使乳腺排乳作用。升壓素促進血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。,（三）促腎上腺皮質激素（ACTH）,39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段： Met-Glu-His-Phe

11、-Arg-Trp-Gly。,（四）腦肽,腦啡肽具有強烈的鎮(zhèn)痛作用（強于嗎啡），不上癮。,Met-腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu,β-內啡肽（31肽）具有較強的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。,（五）膽囊收縮素,（六）胰高血糖素,由胰島α-細胞分泌（β-細胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調節(jié) 維持血糖濃度。,五、 蛋白質的結構,蛋白質是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列。在蛋

12、白質中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構象）（conformation）。在結構中，這種構象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。蛋白質有四種結構層次：一級結構（primary），二級結構（secondary），三級結構（tertiary）和四級結構（quaternary）（不總是有）。,（一）蛋白質的一級結構（化學結構）,一級結構就是蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線性序列。在基因編碼的蛋白質中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序

13、列決定的。一級結構中包含的共價鍵（covalent bonds）主要指肽鍵（peptide bond）和二硫鍵（disulfide bond）,牛胰島素的化學結構,一級結構確定的原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質的完整序列。,目前往往采用從待測蛋白質的基因序列反推出蛋白質的一級結構。,（二）蛋白質的空間結構（構象、高級結構）,——蛋白質分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。

14、,由于羰基碳-氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結構（resonance structure），碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質，由CO-NH構成的肽單元呈現相對的剛性和平面化，肽鍵中的4個原子和它相鄰的兩個α-碳原子多處于同一個平面上。,氨基的H與羰基的O幾乎總是呈反式（trans）而不是順式（cis）。,蛋白質構象穩(wěn)定的原因：1）酰胺平面；2）R的影響。,1. 蛋白質的二級結構,——指蛋白質多肽鏈本身的折疊和盤繞方式,（1）α-螺旋（α-h

15、elix）,Pauling和Corey于1965年提出。,結構要點：1）螺旋的每圈有3.6個氨基酸，螺旋間距離為0.54nm，每個殘基沿軸旋轉100°。,2）每個肽鍵的羰基氧與遠在第四個氨基酸氨基上的氫形成氫鍵（hydrogen bond），氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內氫鍵的形成。,3.613 (ns),3)R側鏈基團伸向螺旋的外側。,4）Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，經常出現在α-螺旋的端頭，它

16、改變多肽鏈的方向并終止螺旋。,（2）β-折疊結構（β-pleated sheet）,是一種肽鏈相當伸展的結構。肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈上的羰基和氨基形成的氫鍵維持結構的穩(wěn)定性。肽鍵的平面性使多肽折疊成片，氨基酸側鏈伸展在折疊片的上面和下面。,β-折疊片中，相鄰多肽鏈平行或反平行（較穩(wěn)定）。,（3）β-轉角（β-turn）,為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉方向，成發(fā)夾形狀。一個氨基酸的羰基氧以氫鍵結合到相距的第四個氨基酸的氨基

17、氫上。,,,,β-轉角經常出現在連接反平行β-折疊片的端頭。,（4）自由回轉,沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結構。酶的活性部位。,2. 超二級結構和結構域,超二級結構是指若干相鄰的二級結構中的構象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認的二級結構組合體。是蛋白質二級結構至三級結構層次的一種過渡態(tài)構象層次。,結構域是球狀蛋白質的折疊單位。多肽鏈在超二級結構的基礎上進一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結構，具有部分生物功能。對于較大的蛋白質分子或

18、亞基，多肽鏈往往由兩個以上結構域締合而成三級結構。,3. 蛋白質的三級結構,——指多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側鏈）在三維空間的分布。,肌紅蛋白,4. 蛋白質的四級結構,——多肽亞基（subunit）的空間排布和相互作用。亞基間以非共價鍵連接。,血紅蛋白,共價鍵,次級鍵,,化學鍵,肽鍵,,一級結構,氫鍵,二硫鍵,,,,二、三、四級結構,疏水鍵,鹽鍵,范德華力,,,,三、四級結構,（三）蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵,肌紅蛋白是195

19、7年由John Kendrew 用X射線晶體分析法測定的有三維結構的第一個蛋白質。它是典型的球形蛋白質，高度折疊成緊密結構，疏水氨基酸殘基大部分埋藏在分子內部，極性殘基在表面。肌紅蛋白中有8條α-螺旋。由多肽的折疊形成的疏水空隙內是血紅素輔基，通過肽鏈上的His殘基與肌紅蛋白分子內部相連，它對肌紅蛋白的生物活性是必需的（與O2結合）。,六、蛋白質分子結構與功能的關系,蛋白質分子具有多樣的生物學功能，需要一定的化學結構，還需要一定的空間構

20、象。,（一）蛋白質一級結構與功能的關系,1. 種屬差異,蛋白質一級結構的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質的功能起決定作用。根據蛋白質結構上的差異，可以斷定它們在親緣關系上的遠近。,2.分子病,——蛋白質分子一級結構的氨基酸排列順序與正常有所不同的遺傳病。,鐮狀細胞貧血（sick-cell anemia）從患者紅細胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細胞。,β-鏈 1 2 3

21、 4 5 6 7Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…,,Val 取代Glu,O2,O2,,（二）蛋白質構象與功能的關系,別（變）構作用：含亞基的蛋白質由于一個亞基的構象改變而引起其余亞基和整個分子構象、性質和功能發(fā)生改變的作用。因別構而產生的效應稱別構

22、效應。,血紅蛋白是別構蛋白，O2結合到一個亞基上以后，影響與其它亞基的相互作用。,Gly的滴定曲線,Gly解離作用,七、蛋白質的性質,（一）蛋白質的相對分子量,蛋白質相對分子量在10 000~1 000 000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,最準確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設計）：蛋白質顆粒在25~50*104 g離心力作用下從溶液中沉降下來。,沉降系數（s）：

23、單位（cm）離心場里的沉降速度。,v =沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉子角速度（弧度/s） x =蛋白質界面中點與轉子中心的距離（cm）,沉降系數的單位常用S，1S=1×10-13（s）,蛋白質分子量（M）與沉降系數（s）的關系,（二）蛋白質的兩性電離及等電點,蛋白質在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負電荷，在等電點pH時為兩性離子。,電泳：帶電顆粒在電場中移動的現象。分子大小不同的蛋白質所帶凈電荷密度不同，

24、遷移率即異，在電泳時可以分開。,1. 自由界面電泳：蛋白質溶于緩沖液中進行電泳。,2. 區(qū)帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。,（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。,（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,1）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。,2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。,等電聚焦電泳：當蛋白質在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。,,通電,（三）蛋白質的

25、膠體性質,布郎運動、丁道爾現象、電泳現象，不能透過半透膜，具有吸附能力,蛋白質溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）； 2）帶相同電荷。,（四）蛋白質的沉淀反應,1. 加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質沉淀析出。,分段鹽析：調節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)

26、2SO4)。,2. 加有機溶劑,3. 加重金屬鹽,4. 加生物堿試劑,單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。,（五）蛋白質的變性,天然蛋白質受物理或化學因素的影響，其共價鍵不變，但分子內部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質發(fā)生部分或全部喪失，稱為蛋白質的變性。,變性蛋白質主要標志是生物學功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈松散，反應基團增加，易被酶消化。

27、,變性蛋白質分子互相凝集為固體的現象稱凝固。,有些蛋白質的變性作用是可逆的，其變性如不超過一定限度，經適當處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|。,,（六）蛋白質的顏色反應,—OH,N,,,,,,（7）成鹽反應,,（8）?；蜔N基化反應,,（9）成酯反應,,HCl氣,當羧基變成乙酯后，羧基的化學性質就被掩蔽了，而氨基的化學性質就突出地顯示出來。,（10）酰氯化反應,,使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基結合，在合成肽的工作上常用。,（11）

28、成酰胺反應,H2N—CHR—COOC2H5 + HNH2,,體外,無水,有機體內：,Asp（Glu）+NH4+,Asn（Gln）,,Asn（Gln）合成酶,ATP,（12）脫羧反應,H2N—CHR—COOH,,脫羧酶,（13）迭氮反應,H2N-CHR-COOH,,,NH2NH2,（-CH3OH）,,HNO2,八、蛋白質的分類,1. 蛋白質形狀,球狀蛋白,纖維狀蛋白,,2. 分子組成,簡單蛋白（按溶解度）,結合蛋白（按輔基）,,核蛋白,糖