藥學院實驗四線粒體和細胞核的制備與觀察

1、二、實驗原理　　線粒體是真核細胞特有的進行能量轉換的重要細胞器。將動植物組織制成勻漿，在適當的懸浮介質中差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的粘度。在一均勻的懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器

2、沉降先后順序是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。,差速離心技術：利用細胞核與線粒體在一定介質中的沉降速度的差異，可采取分級差速離心的方法，將細胞核與線粒體逐級分離出來。　　懸浮介質通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性；pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃-4℃，避免酶失活。,細胞器標記酶的測定是評價細胞器內膜組分和分

3、離純度的主要依據，如線粒體內膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現藍綠色，從而使線粒體顯色，而胞質中的染料被還原成無色。,詹納斯綠B是一種活體染料，能對動植物的細胞或組織在活體狀態(tài)下進行無毒害的染色。由于染料（堿性染料）的膠粒表面帶有陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染部分本身具有陽離子或陰離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆積下來。染色法可以顯示出活細胞內的某種天然結構存在的真實性，且不影

4、響細胞的生命活動?！　imesa是一種復合染料，即為酸性染料與堿性染料的結合物。在水溶液中電離為帶正電和負電的染料離子。,三、實驗材料、用品1. 器材： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機等。2. 材料： 兔肝臟, 玉米黃化苗,3. 試劑：(1) 0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羥甲基氨基甲 烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH7.4)(2)

5、60; 1%詹納斯綠B(Janus green B)染液。(3)  姬姆薩染液（Giemsa）。(4)  1/15 mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）(5) 卡諾（Cornay）固定液。(6) 生理鹽水,四、實驗步驟(一) 兔肝細胞線粒體及細胞核的分離 （動物材料）1.制備肝細胞勻漿： 實驗前將白兔空腹12小時，脫臼處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織0.3g

6、，剪碎；用預冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數次。然后加1.5 ml預冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分數次添加蔗糖溶液，冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，肝勻漿用雙層紗布過濾(濾液制兩張涂片①②).,,涂片過程：,3. 分離物鑒定：（1） 細胞核：將涂片①③（不加蓋玻片）自然干燥后加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸餾水漂洗數秒，用濾紙吸干水，用顯微鏡（40×）檢查，細胞核呈紫

7、紅色，混雜的細胞質為淺藍色碎片。（2） 線粒體：取線粒體沉淀滴在載玻片上，得涂片②④，勿太密。滴加1-2滴1%詹納斯綠B溶液染色，10分鐘后加蓋玻片，吸水紙吸走多余染料，用光學顯微鏡觀察，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。,(二) 玉米線粒體及細胞核的分離（植物材料） 從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能研究外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因――線粒體DNA等目的。 分離線粒體的方法仍采用均勻介質中

8、的差數離心。介質中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二價陽離子，Ca2+除去后細胞間粘著解體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。,1.試劑1）分離介質：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl緩沖液（pH7.4），3 mmol/L EDTA，0.75 mg/ml BSA。2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7

9、.4）。 3）20% NaClO溶液。4）1% 詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。2.器材剪刀，漏斗，研缽，紗布，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機等。,3.實驗方法1）剪取1～2cm長的幼苗黃化苗0.5g，剪碎；加2.0 ml預冷的分離介質，冰浴上研磨成勻漿。2）勻漿用雙層紗布過濾(濾液制兩張涂片①).3）濾液700g離心10分鐘，除去核和雜質沉淀。4）上清夜10000g離心15分鐘，沉淀為線粒體制涂片②5）涂片①②未干時

10、，立即滴加1% 詹納斯綠B染液，染色10分鐘，蓋上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。,五、實驗結果光學顯微鏡觀察，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。,六、實驗報告1.分別描述2張細胞核涂片的結果(如平均每個視野中 所見完整的細胞核數量，完整的細胞或帶有殘留細 胞質的細胞核的約占多少等)2.分別描述鼠和水稻黃化苗的兩張線粒體裝片的觀察 結果,根據你的實驗結果,你認為所分離的線粒體的 純度如何?3.