bacillussp.bsd8肌酸水解酶基因的克隆、表達和酶性質的研究

1、浙江大學生命科學學院碩士學位論文Bacillus sp.BSD-8肌酸水解酶基因的克隆、表達和酶性質的研究姓名：盧紅波申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：馬曉航20080501浙江大學碩士學位論文摘要肌酸水解酶( E C3 ．5 ．3 ．3 ) 是肌氨酸氧化酶法測定肌酐含量方法中的關鍵酶，與肌酐水解酶和肌氨酸氧化酶催化肌酐的降解。肌酸水解酶的降解性能的好壞直接影響到酶法測定在臨床應用中的推廣。雖然人們已經發(fā)現了許多可以產生肌酸水解

2、酶的細菌，但對該酶的性質研究較少。B a c i l l u ss p ．B S D - 8 菌株是由本實驗室從土壤中篩選出的細菌，能夠以肌酐作為唯一氮源生長，但在細菌發(fā)酵過程中卻檢測不到肌酸水解酶。本論文由肌酸水解酶的克隆入手，通過分子生物學方法進行基因克隆，構建肌酸水解酶重組表達菌株，通過誘導表達和純化，獲得重組酶，進而研究該菌株肌酸水解酶性質。本論文的主要研究成果如下：( 1 ) J A B a c i l l u ss p ．B

3、 S D ．8 菌株中克隆肌酸水解酶基因并測序，得到1 2 3 6 b p的片段( a c c e s s i o n n o ．E U 5 4 6 2 2 6 ) ，編碼4 1 1 氨基酸殘基序列。序列分析發(fā)現肌酸水解酶基因的調控序列．1 0 區(qū)、．3 5 區(qū)、S D 序列和終止予后的反向互補序列。( 2 ) 成功進行基因克隆，與質粒p E T 0 2 8 a ( + ) 連接，構建肌酸水解酶重組質粒p E T - 2 8 a - C

4、 R E ，分別轉入大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 、B L 2 1 ( D E 3 ) p L y s S ，并在I P T G誘導下高效表達。( 3 ) 對重組酶進行N i ．I D A H i s ．B a n d 親和柱純化，獲得了高濃度高純度的酶液。純化后的肌酸水解酶比活為9 ．9 4 U ／m g ，在S D S ．P A G E 中顯示為單一條帶。( 4 ) 研究重組酶的各項性質，結果發(fā)現：酶的最適p H 值為

5、7 ．5 ，在p H 5到8 的范圍處理2 4 h 后殘余酶活力均在8 0 ％以上；酶的最適反應溫度為3 7 ℃，在p H 7 ．5 的磷酸鹽緩沖液中不同溫度處理3 0 m i n 后，測定殘余酶活力，結果發(fā)現重組酶在4 5 ℃以下穩(wěn)定；酶的動力學常數K m 是2 0 ．4 9 m M ，k c a t 約為1 2 ．2 ／s ao 。5 ％的S D S ，l m M c u 2 + ，H 9 2 + 和A 礦對酶活具有完全抑制作用，所