天牛腸道細(xì)菌來源植酸酶的基因克隆、表達(dá)及其性質(zhì)研究.pdf

1、植酸酶(Phytase,EC3.1.3.8或EC3.1.3.26)是一類能夠降解植酸并釋放無(wú)機(jī)磷和肌醇的磷酯酶。近些年,植酸酶作為一種新型的飼料添加劑和無(wú)機(jī)磷的替代物,在豬、雞等單胃動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)的應(yīng)用價(jià)值已得到充分體現(xiàn),而在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面,具有應(yīng)用價(jià)值的中性植酸酶亟需開發(fā)。昆蟲腸道作為一個(gè)微生物數(shù)量眾多且復(fù)雜多樣的特殊環(huán)境,目前幾乎沒有相關(guān)植酸酶的報(bào)道。本論文的研究目的旨在從中性的昆蟲腸道環(huán)境中獲得具有新穎性和應(yīng)用潛力的植酸酶。
　　

2、 本研究從云斑天牛腸道環(huán)境來源細(xì)菌中挑選具有種屬差異的20株細(xì)菌,利用簡(jiǎn)并PCR和TAIL-PCR技術(shù),從其中3株細(xì)菌中克隆到4個(gè)植酸酶編碼基因,分別為Pseudomonas sp.TN06來源的phyA06、Serratia sp.TN49來源的phyH49和phyB49、Janthinobacterium sp.TN115來源的phyA115。其中,phyH49為組氨酸酸性磷酸酶(HAP)基因,PhyA06、phyB49和phyA

3、115為β-折疊桶狀植酸酶(BPP)基因。通過氨基酸序列比對(duì)分析,四個(gè)基因與已發(fā)表的植酸酶序列最高序列一致性為47—64％,三個(gè)BPP基因相互之間的一致性為39-51％,說明這四個(gè)昆蟲腸道來源的植酸酶基因均具有較高的序列新穎性。通過同源建模分析,三個(gè)BPP植酸酶均具有雙結(jié)構(gòu)域,與大多數(shù)完成酶學(xué)性質(zhì)分析的單結(jié)構(gòu)域BPP植酸酶不同。Serratia sp.TN49是典型的腸桿菌科細(xì)菌,本研究首次從腸桿菌科中克隆得到BPP基因,并首次從單一菌

4、株中克隆到多個(gè)植酸酶基因。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明phyB49和與植物共生的Pseudomonas spp.來源的雙結(jié)構(gòu)域BPP植酸酶的親緣關(guān)系最相近。四個(gè)植酸酶編碼基因分別重組到pET-22b(+)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。重組蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化達(dá)電泳純后,進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析。
　　 來源于Pseudomonas sp.TN06的PhyA06最適Ca2+濃度是2 mM,最適pH值為7.0,最適溫度是55

5、℃,并在30℃保持50％左右的活性。PhyA06具有較好的熱穩(wěn)定性,在65℃處理1h后,還保留70％以上的相對(duì)酶活。PhyA06對(duì)胰蛋白酶的降解有抗性,胰蛋白酶處理1h,酶活保持不變。該酶的性質(zhì)特點(diǎn)符合水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)植酸酶的需求,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 來源于Serratia sp.TN49的重組植酸酶PhyH49和PhyB49最適pn值分別為5.0和7.5,最適溫度分別為60℃和45℃,在30℃時(shí)相對(duì)酶活力為30％和60％左

6、右。PhyB49最適Ca2+濃度是1 mM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,同時(shí)具有兩類植酸酶的Serratia sp.TN49在pH2.0-9.0范圍內(nèi)都可以有效的利用植酸,增強(qiáng)了對(duì)不同生活環(huán)境的適應(yīng)性。另外,從中性腸道微生物中分離得到中性植酸酶,也符合微生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)性和定向進(jìn)化的趨勢(shì)。
　　 來源于Janthinobacterium sp.TN115的PhyA115最適Ca2+濃度是1mM,最適pn值為8.5,最適溫度是45℃。PhyA11

7、5活性與Ca2+濃度、底物植酸濃度之間有密切的關(guān)系。在Ca2+濃度和植酸濃度一致時(shí),PhyA115具有最高的酶活。在植酸濃度極低(0.1 mM)且無(wú)Ca2+時(shí),PhyA115有較高酶活性,該現(xiàn)象至今尚未見報(bào)道。經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能比較分析發(fā)現(xiàn),不完整的N端結(jié)構(gòu)域雖然沒有降解植酸的能力,但可以改變PhyA115最適pH和pH作用范圍。PhyA115是中性植酸酶基礎(chǔ)理論研究及水產(chǎn)應(yīng)用的良好材料。
　　 本研究首次對(duì)天牛腸道這個(gè)特殊生態(tài)環(huán)境中