細(xì)胞色素b-,6-f蛋白復(fù)合體中葉綠素a的性質(zhì)和功能研究.pdf

1、細(xì)胞色素b6f蛋白復(fù)合體(Cytochrome b6f complex，Cyt b6f)是光合膜上參與光合作用原初反應(yīng)過程的主要膜蛋白超分子復(fù)合體之一。萊茵衣藻和嗜熱藍(lán)細(xì)菌的Cyt b6f三維晶體結(jié)構(gòu)均顯示，每Cyt b6f單體分子含有1分子Chlorophyl1 a(Chl a)，充分肯定了Chl a是Cyt b6f天然成分的觀點(diǎn)(Kurisuet a1,2003；Stroebel et al，2003)。研究表明不同來源的Cyt b

2、6f中Chla單線激發(fā)態(tài)壽命(或熒光壽命)并不一樣，多數(shù)的研究結(jié)果認(rèn)為Cyt b6f中Chla單線激發(fā)態(tài)壽命只有200ps左右，但是也有Cyt b6f中Chla單線激發(fā)態(tài)壽命為～600ps的報(bào)道；而甲醇中游離Chl a的單線激發(fā)態(tài)壽命為4ns左右。針對Cyt b6f中Chla單線激發(fā)態(tài)壽命快速淬滅的現(xiàn)象，Dashdorj等(2005)根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)推測Cyt b6f中Chla單線激發(fā)態(tài)和鄰近的Cyt b6亞基上Tyr105殘基發(fā)生電子交換

3、傳遞，從而快速淬滅Chla單線激發(fā)態(tài)，減少了三線態(tài)Chl a和單線態(tài)氧的產(chǎn)生，并且認(rèn)為這是Cyt b6f保護(hù)自身不受單線態(tài)氧破壞的一種機(jī)制，但是這一推測缺乏有力的證據(jù)。另外，Cyt b6f中Chla的功能仍然未知。本文以菠菜Cyt b6f為對象，結(jié)合多種實(shí)驗(yàn)手段，測定了菠菜Cyt b6f中Chl a單線激發(fā)態(tài)壽命，并對復(fù)合體中Chl a單線激發(fā)態(tài)淬滅的機(jī)理進(jìn)行了深入研究。此外，我們還對復(fù)合體中Chl a可能的功能進(jìn)行了初步地探討。獲得了

4、如下的結(jié)果：
　　 1.針對不同來源的Cyt b6f中Chla單線激發(fā)態(tài)壽命(或熒光壽命)測定結(jié)果不同的報(bào)道，仔細(xì)分析了其中的原因，發(fā)現(xiàn)除了樣品來源的差異外，使用不同的去垢劑可能是一個(gè)不可忽視的因素。在實(shí)驗(yàn)中，不同的研究者分別采用了十二烷基麥芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside，DDM，)和八烷基葡萄糖苷(n-Octylβ-D-glucopyranoside，β-OG)作為溶解樣品的去垢劑。因此，本文借助穩(wěn)態(tài)吸收

5、和穩(wěn)態(tài)熒光光譜、瞬態(tài)光散射技術(shù)，CD光譜和亞皮秒時(shí)間分辨吸收光譜等技術(shù)，分別研究了這兩種去垢劑對Cyt b6f結(jié)構(gòu)和功能的不同影響。結(jié)果表明，DDM去垢劑能使Cyt b6f處于較好的分散體系中，其中血紅素和Chl a分子處于特定的蛋白環(huán)境中，不會(huì)導(dǎo)致Cyt b6f變性；而β-OG去垢劑會(huì)使Cytb6f產(chǎn)生聚合現(xiàn)象，其中的血紅素和Chl a與蛋白環(huán)境的相互作用減弱，和DDM相比其電子傳遞活性顯著降低，Chl a單線激發(fā)態(tài)壽命延長，Chl

6、a更容易被光破壞。通過這一工作，我們優(yōu)化和確定了Cyt b6f的溶解條件，為下面的研究工作打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.利用Tyr的特異性修飾劑p-Nitrobenzenesulfonyl Fluoride(NBSF)對Cyt b6f樣品進(jìn)行特性修飾，經(jīng)原子吸收譜、熒光譜、CD譜、質(zhì)譜等方法對修飾后的樣品進(jìn)行鑒定，并結(jié)合時(shí)間分辨飛秒吸收光譜技術(shù)，測得修飾后的樣品在660nm激發(fā)下Chla單線激發(fā)態(tài)壽命延長，從而在實(shí)驗(yàn)上提供了Ty

7、r與淬滅Chla單線激發(fā)態(tài)有關(guān)的證據(jù)。但是對Cyt b6f中Chl a瞬態(tài)吸收圖譜仔細(xì)研究表明，菠菜Cyt b6f中Chl a單線激發(fā)態(tài)快速淬滅過程中并沒有發(fā)現(xiàn)Tyr與Chla之間發(fā)生電子傳遞時(shí)所形成的Chla·-。以上結(jié)果表明，Cyt b6f中Chl a單線激發(fā)態(tài)快速的淬滅確實(shí)和鄰近的Tyr105有關(guān)，但是與Dashdorj等提出的Chla單線激發(fā)態(tài)和Tyr105殘基發(fā)生了電子交換傳遞從而淬滅Chla單線激發(fā)態(tài)這一想法不符，關(guān)于這一問

8、題值得進(jìn)一步深入研究。
　　 3.紅光和綠光對Cyt b6f照射，Cyt f可以被還原，并且紅光比綠光更容易使Cyt f還原，暗示Cyt f的還原與Chl a的關(guān)系密切，有可能是Chl a被激發(fā)后，其被激發(fā)的電子傳給Cyt f。對這一現(xiàn)象的進(jìn)一步研究表明，Cyt b6f在光照條件下，Cyt f的還原與體系內(nèi)C10-PQ庫的氧化還原狀況相關(guān)，氧化型的C10-PQ可能介導(dǎo)電子從Chla傳向Cyt f。由于在體內(nèi)質(zhì)體醌庫的氧化還原狀態(tài)

9、往往決定Cyt b6f的氧化還原狀態(tài)，而通過對Cyt b6f不同氧化和還原狀態(tài)的吸收譜和熒光譜的研究表明，氧化態(tài)和還原態(tài)的Cyt b6f中，Chl a與蛋白的結(jié)合狀態(tài)是有差異的。這些差異可能暗示著Chl a分子在行使其功能時(shí)與復(fù)合體的氧化還原狀態(tài)是有關(guān)系的。通過以上的結(jié)果，對Cyt b6f中Chl a可能的功能進(jìn)行了假設(shè)。
　　 4.此外，我們還發(fā)現(xiàn)Cyt b6f具有明顯的過氧化物酶活性。在0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液，pH3