一體化生物加工過程進行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產.pdf

1、一體化生物加工過程進行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產一體化生物加工過程進行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產EngineeringEscherichiacolifsuccinateproductionfromhemicelluloseviaconsolidatedbioprocessing（國家自然科學基金項目資助NSFC21176182）（國家973計劃項目資助NO.2011CBA00804，2012CB725203）一級學科：化學工程與技術

2、學科專業(yè)：生物化工研究生：鄭宗寶指導教師：趙學明教授天津大學化工學院二零一二年六月中文摘要中文摘要復雜的結構及解聚所需的高成本是阻礙半纖維素作為底物進行生物燃料和生物化學品生產的主要障礙。一體化生物加工過程（ConsolidatedBioprocessingCBP）通過利用一種微生物同時行使水解酶的生產，生物質原料的降解以及生物產品的轉化這三大功能，能夠顯著降低木質纖維素原料包括半纖維素利用過程的成本。在本文中，通過借鑒代謝工程與合成生

3、物學的基本原理與思想，改造大腸桿菌使其表達分泌三種半纖維素酶，實現了直接以山毛櫸木聚糖為底物進行琥珀酸生產的生物轉化過程。木聚糖酶的胞外分泌是通過與OsmY蛋白的融合實現的。將十二個不同來源的并與OsmY融合的木聚糖內切酶木糖苷酶組合進行酶學表征，選擇出一組具有最優(yōu)酶學特性的木聚糖酶組合，即來自于FibrobactersuccinogenesS85的木聚糖內切酶XynCA以及來自于Fusariumgraminearum的木糖苷酶Xylo

4、A。在該菌株中，木聚糖酶誘導表達8h時，即可向胞外分泌0.180.01gl的蛋白質，木聚糖內切酶活性為12.140.34Umg，木糖苷酶活性為923mUmg。隨后通過一系列措施來進一步優(yōu)化木聚糖酶的表達分泌，以提高其水解效率，更好的滿足CBP生產的需要，包括敲除大腸桿菌Braun’slipoprotein的編碼基因lpp；過表達催化二硫鍵形成的氧化還原酶編碼基因dsbA；優(yōu)化木聚糖酶表達載體的表達水平；通過Blc蛋白于外膜表面展示木糖苷

5、酶；過表達來自于枯草芽孢桿菌168的阿拉伯糖苷酶編碼基因abf2等。將半纖維素水解能力與一株琥珀酸高產菌進行整合，實現了在沒有提供外部木聚糖水解酶及任何有機組分的情況下直接以木聚糖為底物進行琥珀酸的生產。由此構建的大腸桿菌菌株Z6373在厭氧條件下以木聚糖為底物，可以得到0.37gg的琥珀酸，轉化率達到了以木聚糖酸水解液為底物時的76%。本文通過表達和分泌三種半纖維素酶成功的建立起一個大腸桿菌以木聚糖為底物進行琥珀酸生產的CBP系統(tǒng)。本