大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸的輔因子代謝調(diào)控研究.pdf

1、氧化還原輔因子NADH能為諸多生物基產(chǎn)品更高效的合成提供驅(qū)動(dòng)力，ATP是胞內(nèi)維持細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的主要能量物質(zhì)。本課題通過(guò)提高大腸桿菌胞內(nèi)輔因子NADH、ATP的供給，以增強(qiáng)大腸桿菌合成琥珀酸的性能。通過(guò)擾動(dòng)磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway，PP途徑），增強(qiáng)輔因子NADPH和NADH的轉(zhuǎn)化效率，過(guò)表達(dá) ATP合成偶聯(lián)的關(guān)鍵酶基因，阻斷副產(chǎn)物合成途徑，琥珀酸得率從1.12 mol/mol葡萄糖提高到1.56

2、mol/mol葡萄糖，達(dá)到理論得率的91％。
　　PP途徑是細(xì)胞NADPH的主要來(lái)源，在大腸桿菌中NADPH可被轉(zhuǎn)氫酶SthA轉(zhuǎn)化為NADH，因此提高厭氧條件下PP途徑的通量，可為琥珀酸的合成提供還原力NADH。以大腸桿菌ZTK為出發(fā)菌，過(guò)表達(dá)谷氨酸棒桿菌解除變構(gòu)抑制的突變酶基因zwf(243)-gnd(361)，琥珀酸的得率從1.12 mol/mol葡萄糖增加到1.26 mol/mol葡萄糖，提高12.5%。進(jìn)一步過(guò)表達(dá)了PP途

3、徑的相關(guān)基因pgl、talB、tktA，琥珀酸的得率提高至1.3 mol/mol葡萄糖。增強(qiáng)PP途徑通量后，過(guò)表達(dá)sthA（編碼轉(zhuǎn)氫酶SthA）促進(jìn)NADPH轉(zhuǎn)化為NADH。發(fā)酵結(jié)果顯示，sthA的過(guò)表達(dá)明顯提高琥珀酸的得率，達(dá)到1.44 mol/mol葡萄糖，但菌體生長(zhǎng)速率和琥珀酸合成速率都不同程度的下降。
　　為改進(jìn)厭氧條件下菌體生長(zhǎng)和琥珀酸合成速率，琥珀酸合成菌 WSA140中表達(dá)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的pck基因（偶聯(lián)ATP生成